노화에 따른 말초신경 탈수초화 및 근육제어, 기전 연구

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노화에 따른 말초신경 탈수초화 및 근육제어, 기전 연구
Year 2020
Title 노화에 따른 말초신경 탈수초화 및 근육제어, 기전 연구
Authors 류혜지, 박지현, 장영수, 조수진
Abstract
Keywords

Abstract

The human nervous system is composed of the central nervous system (CNS) and the peripheral nervous system (PNS). Each system seems to function independently, but shares some portions. Therefore, the glial cells of each nervous system perform somewhat similar functions, and representative example of this is the similarity between the oligodendrocytes of the CNS and Schwann cells of the PNS. The main function of these cells is to form the myelin sheath, which wrap and protect the axon of neurons. They undergo a process of development, maturation, and regeneration. In each process, several factors, such as c-jun, and signals are involved.
Cells may be damaged or function abnormally through the aging process. As a result, it can have negative consequences for myelination, leading to diseases related to the central and peripheral nervous systems. Therefore, if a path leading to myelinization is found, it will be possible to solve the problem of not forming a normal myelin sheath and the problem that efficient remyelination does not proceed. In this study, drugs that induce Sox10, which are known to affect the myelinization process, were screened in a natural compound library, and four compounds showing an effect on Sox10 induction so far were selected. In the future, we plan to conduct research to find Sox10-inducing compounds applicable to humans through in vivo experiments using mouse models. Using the found compounds, we expect that it will be able to contribute to the study of diseases caused by abnormal myelinization by uncovering the specific mechanism that sox10 has on myelinization.

Introduction

Oligodendrocyte와 Schwann cell에 의해 인간의 신경세포에서 myelination이 진행된다. 생성된 myelin에 의해 axon은 node of Ranvier 구조를 가지게 된다. Node of Ranvier는 axon에 myelin sheath가 형성되지 않은 부분으로 도약 전도를 가능하게 해준다. 이는 신경 전달 속도를 향상시켜주어 인간의 감각 능력과 운동 능력에 있어 필수적인 역할을 한다. 따라서 정상적으로 myelin sheath가 형성되지 않거나, remyelination이 일어나지 않으면 여러 질병을 유발할 수 있다. 이에 대한 대표적인 예가 demyelination으로 인한 multiple sclerosis이다. 이는 뇌나 척수와 같은 신경을 둘러싸고 있는 수초에 손상이 일어나기 때문에 제대로 된 신경 전달이 이루어지지 않는다. 전 세계적으로 이 질병을 앓고 있는 환자는 2,500,000명이 넘을 것으로 추정된다.
현재 myelin sheath 형성에 비정상적인 작동이 일어나는 질병을 해결하기 위해 여러 연구가 진행되고 있는 중이며, 이 연구는 myelin sheath 형성에 관여하는 pathway를 확인하는 것에서 시작한다.
현재 sox10이 myelination 과정에 관여하고 있다는 것이 알려져 있으며, sox 10을 knockdown시킨 mouse에서 myelination 역할을 하는 Schwann cell의 development가 멈춘다는 연구가 있다. 본 팀은 sox10이 Myelination에 중요한 기능을 하는 factor라는 것에 근거하여 myelination pathway를 조절하기 위해 chemical을 선별하였다. Natural Compound library에서 제공되는 Chemical 중 선행 연구를 통해 효과가 있다고 알려진 71개를 대상으로 실험을 진행하였고, in vitro에서의 효과를 입증하기 위한 dual luciferase assay와 western blot을 통해 현재 4개의 chemical로 간추려 놓은 상태이다. 추가적으로, primary cell에서의 효과를 보기 위한 실험을 진행중이다.

Theory

Drug reposition
약물 재창출은 이미 시판 중이거나 임상단계에서 실패한 약물을 대상으로 새로운 기능을 밝히는 기법이다. 기존의 신약 개발은 현재에 이르러 신약 후보 물질이 고갈되었고, 개발에 막대한 비용과 시간이 필요하다는 한계가 있는데, 약물 재창출은 이러한 한계점을 극복할 수 있다.[1] 본 연구에서는 Selleckchem사의 Natural compound library에 존재하는 약물을 Screening 기법을 통해 Drug repostion을 하고자 하였다.

Myelination
PNS의 Myelination을 담당하는 Schwann cell은 높은 지질 함량이 특징인데, 특히 cholesterol은 myelin sheath 합성에 필수적이다.[2] Schwann cell은 일련의 발달 단계 중 Neural crest에서 발생한다.[3] Schwann cell의 전구체는 peripheral nerves에서 성장하는 axon과 함께 이동하여, Neuregulin 1(Nrg 1)과 같은 axonal signal에 의해 살아남거나 분화되어 myelinating Schwann cell이 형성된다. Nrg1-Ⅲ 신호는 Myelination의 시작을 관여하는 것 외에도 Schwann cell 기능, 생존, 이동, 방사성 분류, 수초 두께 등을 제어한다고 알려져 있다. Notxh, JAK-STAT, MAPK를 포함하여 말초 신경 손상 후 Schwann cell에서 여러 신호 경로가 활성화되지만 axon 손상 신호의 특성은 아직 밝혀지지 않았다. Remylination이 될 경우, 새로운 수초는 처음 형성된 수초의 두께보다는 얇다는 특징이 있지만, 이 과정 또한 아직 정확한 기전이 밝혀지지 않았다.

Figure 1. Scheme of development, maturation and repairing of Schwann cells [4]

Demyelination disease
탈수초성 질환은 뇌, 시신경 및 척수의 신경 섬유를 둘러싸고 있는 수초에 손상을 일으킨다. 대표적인 질환으로는 다발성 경화증(MS, Multiple sclerosis)이 있다. 탈수초성 질환과 그에 대한 치료법은 현재 밝혀지지 않았으며, 증상은 사람마다 다르게 나타난다.[5] 조기에 치료를 받는 것이 중요하다고 알려져 있다.

Sox10
Sox(SRY-likebox)10은 Myelin-specific transcription factor로써 late embryonic glial cell lineage, mature myelin-forming cell, early neural crest cell에서 발현된다.[6] 특히, PNS에서 Sox10은 Schwann cell 발달을 위해 여러 단계에서 영향을 미치며 Schwann cell 기능에 본질적으로 필요한 factor이다. Sox10이 결실된 Schwann cell은 말초신경에 존재하지만 성숙하지 못하며, Myelination을 유지하지 못해 세포사멸을 겪기도 한다.[7] 또한 Sox10은 remyelination, differentiation에도 관여함을 뒷받침하는 논문들이 나오고 있다.

MCS (Multiple-species Conserved Sequences)
MCS1C는 Sox10 promoter site이고, MCS4는 Sox10 enhancer로써, 본 실험에서 사용한 vector인 addgene 회사의 pE1B-C-F/Sox10-MCS1C, pE1B-C-F/Sox10-MCS4 vector는 Luciferase가 포함되어 있는 Vector이다. Sox10-MCS vector의 Luciferase assay를 통해 Luciferase 활성을 분석하면 Sox10 발현 정도를 확인할 수 있다.

Methods

Schwannoma culture

본 연구에서는 Schwannoma cell을 실험에 사용했다. 세포는 1% penicillium & streptomycin과 10% fetal bovine serum (FBS)이 포함된 Dubelcco's Modified Eagle Medium (DMEM)에서 배양하였다. 세포 배양 배지는 2일마다 교체하였다.

Primary DRG culture

ICP mouse의 배아 13일에서 embryo DRG (dorsal root ganglion)를 분리하였다. 37℃에서 하루동안 matrigel로 코팅한 12well plate에 DRG를 외이식하였다. 배양배지는 NG media, differentiation media, myelination media 순으로 각각 7일간 처리하였다. NG media 조성은 1% penicillium와 streptomycin, 20ul/ml B-27, 50ng/ml NGF, 4mg/ml D-glucose, 2mM L-glutamine이 첨가된 Neurobasal media이다. Differentiation media의 조성은 1% penicillium와 streptomycin, 1X N2, 50ug/ml NGF, 2mM L-glutamine이 첨가된 DMEM/F12이다. Myelination media의 조성은 1% penicillium와 streptomycin, 16.1 mg/ml Bovine pituitary extract, 0.5uM forskolin, 50ng/ml NGF, 1X N2, 50ug/ml ascorbic acid, 4mg/ml D-glucose, 2mM L-glutamine이 첨가된 MEM(HS 5%)이다. 세포 배양 배지는 2-3일 마다 교체하였다.

Dual luciferase assay

Transfection에 앞서, 96well에서 3×10^3 Schwannoma cell을 37℃에서 24시간 배양하였다. Transfection을 위해 Renilla luciferase gene을 포함하는 pRL-TK와 firefly luciferase gene을 포함하는 pE1B-C-F/Sox10-MCS1C 또는 pE1B-C-F/Sox10-MCS4 플라스미드를 1:1 비율로 혼합하였다. 플라스미드 혼합물 0.1ug과 lipofectamine2000 0.25ul, OPTI-MEM 50ul를 각 well에 처리한 후, 37℃에서 24시간 배양하였다. Chemical 10uM을 각 well에 100ul씩 처리한 후, 37℃에서 24시간 배양하였다. 세포를 얻은 후, 제조업체인 Promega의 프로토콜에 따라 dual luciferase assay를 진행하여 Renilla 및 firefly luciferase activity를 측정하였다. 측정한 결과에 따라 chemical 종류에 따른 Renilla luciferase activity에 대한 firefly luciferase activity 비율을 계산하였다.

Figure 2. Scheme of dual-luciferase assay [8]

Western blot

Sox10 발현 정도를 확인하기 위해, 6h 또는 24h 동안 chemical을 처리한 cell을 RIPA buffer에 protease inhibitor, phosphatase inhibitor, EDTA를 섞은 용액으로 lysis한다. Cell lysate를 BCA assay 하여 단백질 정량을 한 후, 5X loading buffer와 RIPA buffer로 일정한 농도로 희석하였다. 그런 다음 90℃에서 5분간 heat shock했다. Sample을 8% Tris-glycine SDS-PAGE로 분리했다. 분리된 sample은 nitrocellulose membrane으로 전기영동으로 transfer했다. 10% TBS-T에 희석하여 제작한 5% Skim milk에 1시간 blocking했다. 10% TBS-T로 세척한 후, 5% skim milk 희석한 sox10 1차 antibody (Abcam; ab155279) 및 actin 1차 antibody를 membrane에 처리하여 4℃ overnight했다. TBS-T 세척 후, 5% skim milk 희석한 sox10 및 actin 2차 antibody를 membrane에 4℃, 1시간 처리했다. TBS-T 세척 후, ECL detection을 위해 HRP substrate peroxide solution과 HRP substrate luminol reagent를 1:1로 섞은 후, detection했다. 이후 detection 결과를 Image J로 분석하여 sox10에 대한 결과를 actin에 대한 결과를 이용하여 normalization하였다.

Figure 3. Scheme of SDS-PAGE [9]



Result

Figure 4. Selection한 chemical의 dual-luciferase assay 결과. Firefly luciferase의 activity를 Renilla luciferase의 activity로 normalization 하였다. 71개의 chemical 중에서 control에 대해 두 enhancer의 activity가 모두 1.5 배 이상으로 증가한 chemical들을 selection 하였다. (a) Control에 대한 각 chemical의 MCS1C activity. (b) Control에 대한 각 chemical의 MCS4 activity.


Figure 5. Western blot analysis of Sox10 expression. 각 chemical (1uM)을 6h (a, c) 또는 24h (b, d) 동안 처리하였다. Lovastatin, dioscin, simvastatin, alantolactone이 6h 처리했을 때와 24h 처리했을 때 모두 control보다 Sox10의 발현이 증가하였다.



Conclusion

우리는 본 연구를 통해 수초화에 관련되어 있다고 알려진 Sox10을 target으로 정하여 Selleckchem 사의 natural compond library에서 Sox10의 발현을 향상시키는 약물을 탐색하였다. 먼저 선행 연구에서 1차 선별된 71개의 약물을 Schwannoma cell에 처리한 다음 dual-luciferase assay를 수행하여 Sox10의 promoter site인 MCS1C 및 Sox10의 enhancer인 MCS4의 activity를 향상시키는 약물을 탐색하였다. 이러한 방식으로 lovastatin, diosmetin, dioscin, simvastatin, pterostilbene, 3’-hydroxypterostilbene, 5-methoxyflavone, alantolactone을 2차 선별하였다. 그 다음 western blot을 수행하여 2차 선별된 약물들 중에서 shwannoma cell에서의 Sox10의 발현을 향상시키는 약물들을 탐색하였다. 결과적으로 lovastatin, dioscin, simvastatin, alantolactone 등 4개의 약물을 3차 선별하였다.
선별된 4개의 약물 모두 사람에게 큰 부작용이 없는 것으로 알려져 있으며, myelination에 관련된 선행 연구는 존재하지 않다는 것을 확인하였다. 향후 culture한 embryo DRG에 선별된 약물을 처리하여 선별된 약물이 수초화 유도에 효과가 있는지를 in vitro상에서 확인할 계획이다. 그리고 탈수초화 mouse 모델인 Tr-J mouse에 선별된 약물을 투여하여 수초화를 유도하는지를 봄으로써 최종적으로 수초화 유도 약물을 선별할 것이다.
이렇게 선별된 약물은 다발성 경화증 등 탈수초화로 인하여 발생하는 질환들을 치료하는 데 기여를 할 수 있을 것이라고 기대한다. 그리고 말초신경계의 수초화에 관여하는 기작들 중에 아직 밝혀지지 않은 부분들이 많은데 이 약물들이 작용하는 기작들에 대해 연구함으로써 수초화에 관여하는 기작 연구에도 기여할 수 있을 것이라고 본다.

Reference

[1] 김준, 조영우. (2020). 약물 재창출을 활용한 코로나19 치료제 현황. 한국바이오협회.
[2] Salzer, J. L., & Zalc, B. (2016). Myelination. Current Biology, 26(20), R971-R975.
[3] Glenn, T. D., & Talbot, W. S. (2013). Signals regulating myelination in peripheral nerves and the Schwann cell response to injury. Current opinion in neurobiology, 23(6), 1041-1048.
[4] Castelnovo, L. F., Bonalume, V., Melfi, S., Ballabio, M., Colleoni, D., & Magnaghi, V. (2017). Schwann cell development, maturation and regeneration: a focus on classic and emerging intracellular signaling pathways. Neural regeneration research, 12(7), 1013.
[5] Jerry, W. Swanson, MD. Demyelinating disease: What can you do about it?
Retrieved from https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/multiple-sclerosis/expert-answers/demyelinating-disease/faq-20058521
[6] Inoue, K., Tanabe, Y., & Lupski, J. R. (1999). Myelin deficiencies in both the central and the peripheral nervous systems associated with a SOX10 mutation. Annals of Neurology: Official Journal of the American Neurological Association and the Child Neurology Society, 46(3), 313-318.
[7] Bremer, M., Fröb, F., Kichko, T., Reeh, P., Tamm, E. R., Suter, U., & Wegner, M. (2011). Sox10 is required for Schwann‐cell homeostasis and myelin maintenance in the adult peripheral nerve. Glia, 59(7), 1022-1032.
[8] Dual Luciferase (Firefly-Renilla) Assay System.
Retrieved from https://bpsbioscience.com/dual-luciferase-firefly-renilla-luciferase-assay-system-60683
[9] 한국분자·세포생물학회