단일 시행(One-shot)으로 전혈에서 exosome을 추출/정제/정량적 으로 분석할 수 있는 자동화된 이미징 기반 기술 개발

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단일 시행(One-shot)으로 전혈에서 exosome을 추출/정제/정량적 으로 분석할 수 있는 자동화된 이미징 기반 기술 개발
Year 2020
Title 단일 시행(One-shot)으로 전혈에서 exosome을 추출/정제/정량적 으로 분석할 수 있는 자동화된 이미징 기반 기술 개발
Authors 이성희, 이시은, 전수현, 정민찬, 황대원
Abstract
Keywords Exosome, Single-Molecule, TIRF, PD-L1, Tumor

Abstract

Exosomes are one of the extracellular vesicles(EVs) that are released from most eukaryotic cells. As membrane of the exosomes comes from cell plasma membrane, the membrane of exosomes consists of cell membrane components.

There are many studies that tried to extract exosomes and analyze them. However, it takes around 15 hours to extract exosomes by using ultracentrifugation and it needs lots of samples. In addition, to define extracts as exosomes, several test steps are required.

We solve these problems by developing “One-shot kit” which can extracts and quantifies exosomes at the same time. First, We developed experiments based on single-molecule technology that can check whether single molecule binds to antibody and the binding between antibody and dye is one-to-one. By using the data from it, we developed several exosome analysis programs.

The major purpose of the programs is counting the number of exosomes and quantifying the fluorescence intensity of each exosome. To do so, several detailed process is necessary for more accurate counting and quantification. Thus, we made several programs that can do some critical processes such as Gaussian fitting of retrieved raw version intensity data, construction of video-type data adopting Gaussian fitting process, finding the positions of fluorescent spots considered as exosomes, and quantifying fluorescence intensity of found exosomes.

Finally, we developed the kit which can capture the exosomes from the fluid samples directly by using the specific antibodies for exosome membrane proteins(CD63, etc.). Furthermore, we analyzed how many PD-L1 proteins were expressed by using fluorescence-labeled antibody of PD-L1.

Our kit has great advantages compared to previous studies. First, we can use samples directly from whole blood not even using ultracentrifugation. Second, we can specifically capture exosomes from whole blood. Third, we can analysis amount of expressed PD-L1 on each exosome through fluorescence intensity, and it doesn’t dependent to the concentration of samples.


Introduction

Exosome은 최근 질병 진단 및 치료 분야에서 중요하게 다루는 biomarker 중 하나이다. Exosome은 cell-cell communication의 매개체로, 한 세포의 DNA, RNA, 단백질, lipid 등을 다른 세포로 옮기는 데 중요한 역할을 한다. 세포가 망가져서 발생하는 질병들의 경우 exosome을 분석하면 질병의 징후를 확인할 수 있다.

이러한 exosome 연구의 하나로, PD-L1 연구가 있다. 암세포에서 주로 발현되는 PD-L1은, T세포의 PD-1과 반응해 해당 세포를 비활성화하여 암세포에 대한 면역반응을 억제한다. 이러한 사실을 바탕으로, 연구진들은 암세포의 조직검사를 통해 PD-L1의 발현량만 확인할 수 있다면 정밀한 암 진단이 가능할 것이라 판단했다. 그러나 실제 임상에서 PD-L1의 발현량과 암의 성장 속도 사이에 뚜렷한 관계가 나타나지 않았고, 이에 건강보험심사평가원에서는 최근 건강보험 급여적용 기준 항목 중 조직검사를 통한 PD-L1의 발현량 항목을 삭제한 바 있다. 2018년 발표된 논문에 의하면 이 현상은 암세포가 PD-L1을 exosome을 통해 분비하여 원격으로 T세포를 비활성화하기 때문에 발생한다. 즉, 조직검사 결과에는 exosome으로 분비된 PD-L1의 발현량이 포함되지 않으므로 정확한 진단이 불가능했다.

이에 따라 전 세계적으로 암 진단에서 exosome 연구의 중요성이 부각되면서 다양한 연구 결과가 발표되고 있다. 그중에서 주목할 만한 결과는 단일 exosome에서 나타나는 PD-L1의 수가 많을수록 암세포의 성장 속도가 선형적으로 빨라진다는 보고이다. 이 결과로 볼 때 단일 exosome에 존재하는 막단백질의 발현량을 정량적으로 분석하는 것이 매우 중요하다는 점을 확인할 수 있다.

Exosome에 발현된 단백질을 확인하기 위해 연구자들은 일반적으로 Western Blot(WB)이나 ELISA를 사용한다. 이 방법들은 높은 concentration의 시료를 요구하므로, ultracentrifugation을 동반한다. 이때, 전처리 과정에서 많은 시간이 걸리고, 해당 과정에서 시료의 변형이나 손실이 발생할 수 있다.

우리는 광학적 기법을 이용하여 exosome을 한 번에 imaging해서 이런 단점을 없애고자 했다. 우리는 전혈을 특수 표면 처리된 미세 유체 챔버에 흘려보내 exosome을 선택적으로 표면 흡착시키는 방식을 이용한다. 이후, exosome에 형광으로 라벨링된 단백질을 부착시키고, TIRF를 이용해 형광 이미지를 얻는다. 형광의 세기를 머신 러닝 기반 프로그램을 통해 분석하여, exosome 표면에 발현한 단백질의 개수를 분석한다.

Theory

Exosome

세포의 exosome 분비 모식도

세포는 vesicle, macromolecular complex, 이온 등을 세포외로 분비한다. 세포는 세포 내 환경과 외부 환경, 자극에 따라 세포 외로 vesicle을 분비한다. Exosome은 extracellular vesicle의 일종으로, 약 30~200nm 지름을 가진다.

Total Internal Reflection Fluorescence(TIRF) microscope

Total internal reflection(전반사) 현상은 굴절률이 큰 매질에서 굴절률이 작은 매질 방향으로 전자기파가 진행할 때, 두 매질의 경계면에서 작은 매질 쪽으로 전자기파가 투과하지 못하고 경계면에서 모두 반사되는 현상을 말한다. 이때 전자기파 형태로는 매질의 경계면을 통과할 수 없으나 evanescent field의 형태로 에너지가 일부 투과한다.

전자기파 진행 모식도

위 그림에서 angular frequency가 [math]\omega[/math]인 전자기파가 굴절률이 큰 매질1(절대 굴절률 [math]n_1[/math])에서 작은 매질2(절대 굴절률 [math]n_2[/math]) 방향으로 진행한다고 가정한다. 입사파 [math]\vec{E_I}[/math], 반사파 [math]\vec{E_R}[/math], 굴절(혹은 투과)파 [math]\vec{E_T}[/math]가 모두 동일한 xy-plane 상에 존재한다고 가정할 때, 각각의 wave vector와 법선이 이루는 각이 위의 그림과 같이 주어졌다고 하자. 입사각 [math]\theta_I[/math]이 임계각보다 큰 경우에 발생하는 evanescent field는 아래의 식처럼 나타낼 수 있다.

[math]\vec{E_{evan}}=\vec{E_{T0}}e^{-\alpha y}e^{i(k_1x-\omega t)}[/math]

[math](\alpha = |\vec{k_{T}}|\sqrt{\frac{\sin^{2}\theta_{I}}{n^{2}} -1}, k_{1}=|\vec{k_T}|\frac{\sin\theta_{I}}{n}, n=\frac{n_{2}}{n_{1}})[/math]

위의 식을 바탕으로, 경계면에서 멀수록 field는 exponentially decay하는 것을 알 수 있다.

이러한 점을 활용하여 fluorescent dye로 라벨링한 sample을 microscope slide에 얹어 관찰할 때, TIRF microscopy는 slide 아래에서 레이저를 쏘아보낸다. Slide glass와 sample이 놓여있는 매질의 경계면에서 전반사가 되게끔 입사시키고, sample의 evanescent field에 의한 fluorescent dye의 excitation 및 emission을 유도시킨다. 이때 evanescent field가 illumination을 시킬 수 있는 범위는 입사각에 따른 위의 식의 α값에 의해 결정이 된다. 가시광선 영역의 레이저를 사용할 때, evanescent field가 대략 200nm보다 먼 거리(i.e. bigger y)로 갈수록 field의 세기가 [math]e^{-\alpha y}[/math] 항에 따른 exponential decay에 의해 무척 작아진다. 이로 인해 기존의 epi-fluorescence microscopy와는 달리 입사각에 따라 evanescent field의 투과 깊이를 조정하여 원하는 범위 내 fluorescent dye만 선택적으로 illumination이 되게끔 하여 fluorescence signal을 noise로부터 더 선명하게 식별할 수 있다. 단, evanescent field의 투과 깊이가 200nm 이내 수준에 머무는 만큼, 크기가 큰 bio-sample의 관찰, 예를 들어 cell 내부를 관찰하는 데는 어려움이 있다. TIRF microscopy가 주로 활용되는 상황은, cell 내부가 아닌 외부 표면의 구조 혹은 표면에 존재하는 작은 bio-molecule의 dynamics 추적 등이 있다.

TIRFM 모식도

미세 유체 챔버 설계 및 구현

PEG slide에 antibody와 exosome이 binding한 모식도


챔버 설계에 사용된 antibody들은 각각 host animal을 다르게 설정해 non-specific binding을 최소화하도록 설계됐다. 챔버 설계에 사용된 물질과 그 기능은 다음과 같다.

- mPEG(Methoxy-polyethylene glycol) : 단백질의 non-specific binding을 효과적으로 줄인다.

- PEG-Biotin : Biotin labeled PEG으로, biotin은 NeutrAvidin 단백질과 매우 잘 binding 하는 것으로 알려져 있다. 이후 다른 antibody들을 잡기 위한 NeutrAvidin이 슬라이드에 붙을 수 있게 하기 위해 사용되었다.

- NeutrAvidin : Biotin과 binding affinity가 높은 단백질. PEG-Biotin에서 biotin과 binding 하며, Biotin-GAR(Goat anti-rabit)에서 biotin과 binding 한다.

- Biotin-GAR (Goat anti-rabbit IgG) : Biotin이 부착된 Goat anti-rabbit 2차 항체이다. Goat에서 만들어진 rabbit의 면역항체와 binding하는 secondary antibody이다. Biotin은 NeutrAvidin과 specific binding을 가능하게 한다.

- Rabbit CD63 antibody : rabbit에서 만들어진 CD63 단백질에 specific binding하는 primary antibody이다. CD63은 대부분의 exosome에서 특이적으로 발현하는 membrane 단백질이다. Rabbit에서 만들어졌으므로 GAR과 specific binding이 가능하다.

- Mouse CD63 antibody : mouse에서 만들어진 CD63 단백질에 specific binding하는 primary antibody이다. Mouse에서 만들어졌으므로 Donkey anti-mouse IgG, secondary antibody와 binding이 가능하다.

- Donkey anti-mouse IgG (AF555) : fluorescent secondary antibody로, 555nm 파장의 빛에서 excitation하고, 565nm 파장의 빛을 emission하는 형광 dye가 부착되어 있다. mouse에서 만들어졌으므로 mouse CD63 antibody와 specific binding 가능하다.

Method

PEG slide making

미세 유체 chamber를 만들기 위한 Slide와 cover slip을 준비하는 과정이다. Slide 양끝에 드릴을 이용해 5개씩 두 줄로 구멍을 낸다. Slide와 cover slip은 coplin jar에 넣어 진행한다. Slide와 cover slip을 넣은 coplin jar와 빈 coplin jar, 그리고 작은 conical flask를 준비한다. 빈 coplin jar는 이후 단계에서 처리를 한 slide와 cover slip을 보관하는 용도로 쓰이며, conical flask는 Aminosilane을 준비할 때 사용한다. 모든 coplin jar에 KOH 1M 용액을 넣고 30분간 sonication한다. 이후 slide와 cover slip이 있는 coplin jar는 MQ water로 씻어내고 빈 jar, flask는 MtOH로 씻어낸다. 각각의 용액을 다시 채워서 30분간 sonication한다. 새 용액으로 갈아준다. 사용할 aminosilane을 미리 꺼내서 실온으로 맞춘다.

Glass와 cover slip이 없는 jar의 용액을 버리고 [math]N_2[/math]로 말린다. 모든 slide를 MQ water로 씻어내고 [math]N_2[/math]로 말리고 Burner로 1분간 열처리한다. Cover slip도 같은 방법으로 하되 열처리를 10여초 진행한다.

Conical flask의 MtOH을 버리고 200mL MtOH과 2mL glacial acetic acid 용액으로 채운다. 이후 sonication을 1분간 진행한다. 이어서 2mL aminosilane을 넣어 pipet으로 잘 섞어준 뒤, slide와 cover slip이 있는 jar에 부어준다. Jar를 1분간 sonication하고 10분간 어두운 곳에 둔다. 한번 더 반복한다. Aminosilane reaction은 PEG을 glass 표면에 부착시킬 수 있도록 만들어준다.

NaHCO3 100mM 용액을 만든다. 동시에 PEG reaction 동안 Slide와 cover slip을 둘 humidified chamber를 준비한다. Humidified chamber는 빈 pipet tip box에 물을 채워놓고 pipet tip으로 거치대를 만들어서 준비한다. PEG reaction에 필요한 PEG 용액은 앞서 만든 [math]NaHCO_3[/math]용액 320uL와 m-PEG-SVA 약 80mg, biotin-PEG-SC 약 2mg을 섞어 만든다. 잘 섞이지 않아서 pipetting과 centrifugation을 이용해서 최대한 섞이도록 한다. 또한 거품이 용액에 남아있어서는 안되기 때문에 마지막 Centrifuging 이후에는 pipetting을 해서는 안된다.

Aminosilane reaction을 끝낸 slide와 cover slip을 MQ water로 씻어내고 [math]N_2[/math]로 말린다. Slide를 먼저 humidified chamber에 올리고 PEG 용액 65uL와 Cover slip을 샌드위치처럼 올린다. 이후 적어도 6시간동안 어두운 곳에 둔다. 이어서, Slide와 cover slip을 떼내어 MQ water로 씻어내고 [math]N_2[/math]로 말린다. 50mL tube에 넣어 진공포장하고 냉동보관할 수 있다.

Chamber making

PEG처리를 한 slide와 cover slip 한 쌍을 미리 꺼내 실온에 맞추고, 양면 테이프를 얇게 잘라 slide의 각 구멍 사이에 붙여준다. 결과적으로 5개의 channel이 형성된다. 붙인 slide 위에 cover slip을 올리고 Epoxy로 sealing한다. Slide와 cover slip이 맞닿는 면이 PEG 처리가 된 면이다.

PEG slide chamber 모식도

HeLa cell culture

HeLa cell은 한국세포주은행에서 구매해 사용했다. Subculture는 DMEM, Anti-bacterial/Anti-fungal, FBS 구성으로 된 배지를 사용했다. 여기서 내온 배지를 처리해 Exosome detection에 이용했다. 이후의 연구에서 사용할 배지의 FBS가 exosome extraction kit를 사용할 때에 방해를 할 가능성이 있어서 제외하고 진행했다.

PEG quality check

PEG slide가 잘 만들어졌는지 확인하기 위한 실험이다. 먼저, crimson beads를 chamber에 loading해서 TIRF system alignment에 사용했다. Non-specific binding이 적을 수록 quality가 좋다고 할 수 있다. 이론적으로 binding이 잘 되지 않는 조합으로 Loading을 해서 check한다.

Fluorophore quality check(one-to-one binding check)

주로 사용하는 AF555 형광체와 붙은 Donkey Ab 사이에 1:1로 결합을 하는지 확인할 필요가 있었다. 정량적인 측정을 할 때, 계산 상의 오류를 줄이기 위해서 필요한 단계이다. 1:1 결합을 한다는 것은 형광체가 bleaching할 때 떨어지는 step이 one step여야 한다. Time tracing으로 형광체의 시간변화에 따른 intensity 값을 측정할 수 있고 자체 제작한 프로그램으로 step counting을 진행했다.

Exosome detection

PEG slide에 antibody와 exosome이 binding한 모식도

그림과 같은 순서로 loading해서 detecting을 시도했다. PureExo exosome isolation kit(Fisher)를 이용해 HeLa cell의 culture media로부터 exosome을 추출하여 사용했다. Image 상 보이는 밝은 점들이 exosome이라는 것을 확실히 하기 위해, Donkey antibody(with AF555)와 Cy5 형광체로 labeling한 antibody를 동시에 넣어 같은 위치에서 형광을 띄는지 확인했다. 또한 Nanodrop을 이용해서 exosome concentration의 정량적인 측정을 했다.

전처리 단계

Gaussian fitting for uniform illumination

형광 현미경에 쓰이는 레이저가 주사되는 영역 내에 있는 모든 fluorescent dye들을 완전히 균일하게 illumination 시킬 수는 없다. 기술적 한계로 인해 사용되는 레이저에서 발사되는 빛의 intensity는 gaussian 형태를 띈다. 다시 말해, 좌측 이미지와 같이 intensity가 가장 강한 주사 영역의 정가운데부터 가장자리로 갈수록, 동일한 fluorescent dye라도 intensity가 더 적어지는 현상이 발생한다. 이를 현미경 기계에 내장된 reverse Gaussian filter를 이용하여 관찰 영역 내 dye의 균일한 illumination을 유도할 수도 있다. 그러나 주사되는 laser intensity가 커질수록, 혹은 레이저 주사 영역 범위가 커질수록 filter에 의한 기대효과는 미미하다. 이에 non-uniformly illuminated data(이하 non-uniform data)를 프로그램 상에서 수식적인 계산을 통해 우측 이미지처럼 균등하게 illumination 시켜 취득한 data(이하 uniform data)처럼 바꾸는 방안이 존재한다.

위의 방법을 사용하기 위해서, 형광 현미경에서 얻은 사진 데이터의 pixel별 intensity 값을 행렬 형태로 MATLAB에 입력 받는다. 레이저에서 나오는 빛의 intensity 분포는 gaussian형, 즉 중앙이 가장 밝고 가장자리로 갈수록 어두워지는 분포를 가지고 있다. 행렬로 받은 데이터에서 행렬의 중앙으로 갈수록 intensity 값이 커지는 경향성을 위의 그림에서 볼 수 있다.

Exosome의 position을 찾고, 해당 exosome의 형광 intensity를 정량화하는 과정에서 위의 그림과 같은 non-uniform illumination은 장애가 된다. 이러한 data를 적절한 처리 과정을 거쳐 uniform data에 가까워지게 하는 과정이 필수적이다. 평활화 시킨 데이터의 plot 이미지에서 non-uniform data가 gaussian function의 모양과 어느 정도 유사함을 알 수 있다. 이 점에 기인하여 해당 non-uniform data에 근사적으로 잘 부합하는 gaussian function의 parameter들을 optimization을 통해 도출하고, non-uniform data를 uniform data로 변환시키는 "Gaussian fitting" process를 MATLAB에서 구동한다. Fitting 과정에서 도출되는 optimized gaussian function은 다음 그림처럼 non-uniform data와 거의 비슷한 분포를 가지는 parameter를 적절히 찾아준다.

Optimized parameter를 도출한 fitting process의 최종 결과물은 우측 그림과 같은 uniform data가 된다. 초기 non-uniform data를 smoothing한 data에서 Gaussian distribution을 도출한다. 해당 Gaussian distribution을 raw image data에서 적절히 제거해주는 과정을 통해 최종적으로 uniform image를 얻게 된다.

Background correction

Exosome에 labeling된 dye의 형광 intensity 정량화에 앞서, 언급한 non-uniform illumination와 더불어 background noise도 장애가 될 수 있다. 본 UGRP 팀은 시시각각 변해가는 형광 intensity를 시간대별로 저장하지 않고, 첫 프레임만으로도 exosome에 발현된 PD-L1의 정량적인 측정을 할 수 있도록 목표하고 있다. 이때, background noise는 정량화 과정에서 적지 않은 오차를 발생시킬 수 있다. 이에 background noise를 uniform image에서 적절히 빼주어 형광 이외의 intensity를 정량화 과정에서 배제할 수 있게끔 한다. 이때 background noise를 image 내 국소 영역마다 계산하여 빼주는 것이 가장 이상적이나, 소요 시간에 비해 noise 제거 효율이 생각만큼 높지 않기에 image 전체 영역에 대해 하나의 noise intensity value를 계산하여 빼주는 것으로도 정량화 과정에서 noise에 의한 오차 발생을 충분히 줄일 수 있다.

Diagram of background-correction process

Uniform image로 구성된 video-type data 생성

현미경에 연동된 소프트웨어를 통해 가져온 data는 수백 프레임으로 구성된 일련의 non-uniformly illuminated video 파일로 볼 수 있다. Chamber 내 한 영역을 1~2분간 촬영하는 동안 주사하는 레이저 각도, 위치는 고정되어 있다. 촬영하여 얻은 time-tracing data에서 첫 번째 프레임의 데이터를 이용해, 앞서 언급된 Gaussian fitting 과정을 거쳐 해당 프레임을 uniform하게 만들 수 있는 parameter를 우선 계산한다. 계산된 parameter가 나타내는 Gaussian distribution은 1~2분간 sample을 관찰하는 동안 고정적으로 존재하는 레이저의 non-uniform light intensity distribution이라 가정하고, 첫 번째 프레임에서 도출한 Gaussian distribution을 time-tracing data 전체 프레임에 대해 빼준다. 이후 uniform해진 첫 번째 프레임에서 background intensity를 계산하고 이를 모든 프레임에 빼주는 과정을 이행한다. Gaussian fitting과 background correction까지 마친 일련의 프레임을 MATLAB 내 하나의 "cell"-type variable에 저장하면 실제 확장자명이 video는 아니지만 video type처럼 data를 저장할 수 있고, 본 data는 추후 분석 프로그램에서 이용한다.

분석 단계

GUI(Graphic User Interface)-based analysis program.

전처리 단계를 거친 유사 video data에서 위 그림에 보이는 프로그램을 통해 exosome의 위치와 각 exosome의 시간별 intensity 변화 그래프를 도출해낼 수 있다.

Fluorescence spot의 위치 색출

주어진 video data에서 첫 번째 프레임 내에 fluorescence spot의 위치를 색출한다. Exosome에는 fluorescent dye를 labeling 했기 때문에 특정 기준(threshold) 이상의 intensity 값을 가지는 위치가 곧 exosome의 위치일 것이라 생각할 수 있다. 모든 fluorescence spot이 exosome과 같다고 할 수는 없기에 프레임 내 fluorescence spot의 위치를 우선 색출 후 exosome이라 신뢰할 만한 spot만을 추후에 선택한다.

Fluorescence spot과 background를 가르는 기준 intensity를 구하기 위해서는, 우선 첫 번째 프레임 전체에 걸쳐 intensity에 대한 히스토그램을 확인한다. 도수가 가장 큰 intensity보다 더 큰 intensity 값을 적절히 설정하여 해당 기준보다 큰 intensity 값을 가지는 위치를 프로그램 상에서 계산하게 한다. 여기서 spot의 위치라 함은 fluorescence spot의 중심부 위치를 의미하고, 프레임 별 intensity data가 행렬로 나타나기 때문에 threshold보다 큰 intensity를 가지는 위치를 저장한다는 것은 곧 행렬의 entry 중에 threshold보다 큰 값을 가지는 entry의 행과 열 번호를 저장한다는 것을 의미한다.

Size-exclusion algorithm for selection of fluorescence spots emitted from exosomes

모든 fluorescence spot의 출처가 항상 exosome일 수는 없다. Exosome이 아닌 다른 물질과의 non-specific binding이 발생할 확률이 있다. 따라서, 문헌에 알려진 정보를 토대로 화면 내 모든 fluorescence spot에서 exosome spot을 색출해야 한다. 이러한 색출 과정에 기준이 될 수 있는 정보는 exosome의 크기이다. Exosome은 직경이 30nm에서 최대 200nm 정도라는 것이 알려져 있고, 실험에서 사용한 현미경 카메라로 볼 수 있는 화면의 한 픽셀이 약 180~200nm임을 확인하였다. Fluorescent dye에서 방출되어 현미경으로 입사하는 빛의 회절이 얼마나 되는지는 명확히 측정할 수 없지만 exosome의 크기를 고려했을 때 fluorescence spot의 가로 세로 길이가 아무리 커도 3픽셀보다는 작을 것으로 예상할 수 있다. 이에 앞서 첫 번째 프레임 내 fluorescence spot의 중심부 위치를 추적했을 때, 해당 중심부 위치 근방에 threshold보다 큰 intensity값을 가지는 행렬 entry 개수가 많거나 spot의 상하좌우 길이가 3픽셀보다 긴 경우 해당 spot은 exosome이 아니라고 간주할 수 있다. 추후 PD-L1을 형광 intensity를 통해 정량화할 때 해당 spot에서의 정보는 취하지 않는다.

위 과정에서 exosome이 아닌 spot을 배제할 수 있으나 서로 다른 exosome이 인접하여 spot이 하나로 뭉치는 경우처럼 exosome에서 나오는 fluorescence signal이 본 algorithm에 의해 분석에서 제외되는 경우가 일부 발생할 수 있다. 그러나 본 algorithm을 통해 배제된 실제 exosome 정보가 있더라도 타 exosome spot을 90% 이상 색출이 가능한 것을 확인하여 일부 배제된 실제 exosome 정보를 무시해도 괜찮을 것이라 판단했다.

Hidden Markov Model and its application on the quantification of PD-L1 expressed on exosomes

본 UGRP 연구에서는 PD-L1의 정량적 측정 방법으로 한 프레임에서 PD-L1에 부착한 fluorescent dye 하나의 intensity를 알 때 해당 프레임 내 exosome에서 발하는 형광 intensity 값을 해당 dye 하나의 intensity 값으로 나누어 실제 개수를 구하는 방향을 지향하기에 지속적인 exosome 포착을 비롯해 PD-L1의 marker인 Alexa Flour 555(이하 AF555) dye 하나가 발할 수 있는 intensity 값의 계산이 수반되어야 한다. 이에 AF555 dye 하나의 fluorescence intensity가 대략 어느 정도인지를 별개의 실험에서 형광 현미경을 통해 얻은 time-tracing data로부터 계산할 필요가 있다. 이를 위해 전처리 이후 색출된 fluorescence spot의 시간에 따른 fluorescence intensity 변화를 spot마다 저장하여 step-analysis 프로그램을 통해 AF555의 single intensity 분포를 계산한다.

실제 fluorescent dye는 끊임없이 형광을 발하지 않고 일정 시간이 지나면 irreversible photobleaching 현상, 즉 dye가 완전히 dark state가 되어 형광이 더 발하지 않는 상태에 다다르게 된다. 이 현상을 이용하면 하나의 dye에서 형광이 꺼지는 photobleaching과정이 현미경을 통해 포착하여 해당 dye 하나가 발할 수 있는 형광 intensity를 계산할 수 있고, 화면에 포착된 모든 dye에 대해 평균값을 취하여 추후 exosome 분석에 활용할 계획이다.

Single fluorescence intensity를 photobleaching step의 포착을 통해 계산해야 하기에 한 fluorescence spot으로부터 뽑은 time-tracing data에서 step이 발생하는 시점을 자동으로 포착 가능한 프로그램을 설계할 필요가 있다. 이러한 step detection을 하는 방법에 대해 기존에 이루어진 연구와 해당 자료가 적지 않게 있고, 본 UGRP 팀에서는 이 중 Hidden Markov Model(이하 HMM) algorithm을 이용한 프로그램 설계를 목표로 하였다. HMM은 본 연구에서와 같이 fluorescence data에 대한 분석을 위해 이용되는 대표적인 stochastic model 중 하나로, Markov model을 따르는 system이 시간에 따라 드러내는 state가 관찰자에게는 숨겨져 있다고 가정한다. 해당 system에서 도출된 데이터로부터 system이 드러낼 수 있는 state는 무엇인지, 시간에 따른 state의 변화는 어떻게 발생하고 해당 변화가 발생할 가능성은 얼마인지, 각 데이터 포인트에서 습득한 물리량은 어느 state에서 도래했는가 등을 추적하는 algorithm에 HMM이 활용될 수 있다.

HMM에 기반한 분석 algorithm에서 쓰이는 주요 parameter에는 emission probability, transition probability, forward probability, backward probability가 있고, 본 parameter들의 값은 관찰하는 single-molecule level system의 물리적 특성 및 물리량과 큰 상관 관계를 가진다. 본 HMM algorithm의 parameter를 설명하기 위해 time-traced fluorescence data [math]I=[I(1) ... I(t) ... I(T)][/math][math]1\lt =t\lt =T, t\in \mathbb{N}[/math]에 대해 주어지고, 편의상 관찰된 system이 N개의 state 중 한 state에 머무를 수 있다고 가정하자. 이 중 emission probability [math] ep(t ;j) [/math]는 관찰된 fluorescence 데이터에서 시점 t에서의 fluorescence intensity [math]I(t)[/math]가 주어졌을 때 system에 내포된 여러 state 중 j번째 state에서 [math]I(t)[/math]라는 값을 방출할 수 있는 확률을 말한다. 다음으로 transition probability [math]Tr(i,j)=a_{ij}[/math]는 system이 i번째 state에서 j번째 state로 변화될 확률을 의미한다. System 내 임의의 i번째 state에 대해 [math] \sum_{j=1}^N a_{ij} =1[/math]을 항상 만족해야 하고, N×N 행렬의 i번째 행 j번째 열 entry에 transition probability 값 [math]a_{ij}[/math]을 갖는 하나의 transition matrix로 나타내기도 한다.

위의 emission, transition probabilities가 주어졌을 때 forward probability [math]Fr([I(1)…I(t)];t;j|ep ;Tr)[/math]과 backward probability [math]Br([I(1)…I(t)];t;j|ep ;Tr)[/math]는 다음과 같이 정의된다.

[math]Fr([I(1)…I(t)];t;j|ep ;Tr) = \sum_{i=1}^N {Fr([I(1)…I(t-1)];t-1;i|ep ;Tr)\times a_{ij}\times ep(t;j)}[/math] [math]Br(t;j)=Br([I(t+1)…I(T)];t;j|ep ;Tr)= \sum_{i=1}^N {Br([I(t+2)…I(T)];t+1;i|ep ;Tr)\times a_{ji}\times ep(t+1;i)}[/math]

위의 두 probabilitiies의 곱 [math]P(t;j)=Fr(t;j)Br(t;j)[/math]를 state probability라고 칭하면 state probability [math]P(t;j)[/math]는 시점 t에서 system이 j번째 state에 있을 확률을 의미하고, 각 시점 t마다 N개의 state에 대해 state probability를 계산한 결과를 [math]N \times T[/math] 행렬에 저장하고 이 행렬을 state matrix라고 칭한다. 결론적으로 state matrix에서 각 열마다 state probability가 가장 큰 entry의 행 번호를 추적하여 [math]1 \times T[/math]행렬에 각 열마다 열거하면 이는 곧 주어진 실험 데이터 [math]I=[I(1) ... I(T)][/math]에 확률상 가장 잘 부합하는 state 데이터가 됨을 알 수 있다.

궁극적으로 system의 물리적 특성에 근거하여 emission probability와 transition probability가 계산되어야 위의 시간에 따른 state 변화를 도출할 수 있다. 이에 emission probability의 계산을 위해 실험 및 프로그램에서 취득한 각 fluorescence spot의 time-tracing data에서 각 시점마다의 intensity값에 대한 히스토그램을 얻어 해당 히스토그램 데이터를 도출할 수 있는 확률 분포를 근사적으로 계산한다. 그리고 이 확률 분포의 limiting distribution을 한 개 이상의 gaussian(혹은 normal) distribution의 합으로 간주하여 MATLAB에서 히스토그램에 근사적으로 부합하는 여러 gaussian distribution의 parameter들을 계산하고 해당 parameter들에 근거하여 emission probability를 도출한다. 이후 initial transition matrix를 실험에서 얻은 time-tracing data I=[I(1) ... I(t) ... I(T)]가 주어졌을 때 위의 emission probability만으로 각 시점 t마다 I(t)가 나올 emission probability가 가장 큰 state를 추적하고서 일련의 state 데이터를 통해 transition matrix를 구성한다. 마지막으로 주어진 emission probability와 transition matrix에 근거해 실험 데이터에 각 시점마다 확률상 가장 잘 부합하는 state를 추적하여 실험 데이터에 대한 분석을 이행한다. 이러한 분석 과정을 이용해 AF555 dye 하나의 fluorescence intensity를 많은 수의 fluorescence spot으로부터 도출하여 intensity의 분포를 알아내고 이 분포에 기반하여 exosome에 존재하는 PD-L1에 AF555를 labeling하여 관찰한 실험 결과를 통해 AF555로부터 나오는 fluorescence intensity에 의한 PD-L1의 정량적 측정을 도모한다.

Example of histogram fitting
xample of tracking states along the given time-tracing data

Result

AF555 single molecule check

1: T50 only. 2: AF555 1pM. 3: AF555 10pM. 4: AF555 100pM. 5: AF555 1nM

Imaging 분석을 하기 전에 먼저 해야할 것은 Image에 충분한 개수의 점들이 보이는 농도를 찾는 것이다. 5개의 channel 중 첫 번째는 T50 buffer만 넣어서 Background noise를 확인했고, 두 번째에서 다섯 번째까지는 AF555 donkey Ab의 농도를 1pM에서 10배씩 늘려 loading했다. 4개의 channel에서 가장 적절한 개수로 나타난 것은 4번 channel이며 농도는 100pM이다.

Time Tracing으로 Photo bleaching step counting하는 program

MATLAB coding으로 Image의 time tracing data를 분석하는 과정이다. Fluorophore는 빛에 계속해서 노출되면 원래의 형광을 유지하지 못하고 Intensity가 떨어지게 된다. 이것을 photo bleaching이라고 한다. 이론상 Fluorophore가 Ab에 하나만 붙어있다면 bleaching step이 하나이다. Step 개수를 data화 했을 때 step이 한 개인 경우가 약 75%정도로 보였다. 이 결과는 전체 image의 개수가 400여장 정도에서 분석한 것이므로 더 많은 수의 image를 분석한다면 더 큰 차이를 보일 것으로 예상한다.

Histogram of Step Number

Exosome sample loading

1: T50 only. 2: 100pM AF555. 3: Nonspecific. 4,5: Exosome sample(x0.5).

1번, 2번, 3번 channel은 Background noise와 Nonspecific binding을 검출하기 위해서 만든 것이다. 4번과 5번 channel에 받은 Exosome sample을 0.5배 Dilution해서 loading했다. 하지만, Exosome을 Loading한 channel에서 보이는 점의 개수가 2번 channel, AF555 100pM 형광체의 개수보다 훨씬 작고 눈에 보이지 않을 정도였다. Exosome의 농도가 너무 작아서 보이지 않는 것이다. Exosome sample의 정확한 농도를 알 수 없는 상황에서 진행한 실험이어서 Single AF555 실험에서 적절한 농도를 찾았던 것과 다르게, Exosome imaging을 할 때 필요한 농도는 찾을 수 없었다.

HeLa cell culture media and extracted exosome loading

(좌) HeLa cell culture media. (우) Kit로 추출한 Exosome

적절한 Exosome 농도를 찾기 위한 실험을 진행하던 중 Exosome sample을 더이상 사용할 수 없게 되어 기존에 subculture를 하고 있던 HeLa cell의 배지를 이용하기로 했다. HeLa cell은 자궁경부암의 세포이며, Exosome을 분비하는 것으로 알려져있다. 먼저 진행한 실험에서는 Culture media에 일정량의 exosome이 있을 것이라는 가정하에 진행했다. 하지만 예상보다 너무나 적은 양으로 보여서 Media로부터 Exosome을 추출할 수 있는 Kit를 사용하기로 했다. 오른쪽에 보이는 image가 Kit를 사용한 것이다. 두 결과를 놓고 비교해봤을 때, 모두 개수가 너무나 작아서 Background noise와 큰 차이가 없었다.

Exosome Co-localization

Co-localization(Donkey-AF555(파랑),mCD63-Cy5(노랑)
Loading Scheme

Exosome의 농도가 낮게 보이는 이유가 PEG slide 자체가 깨끗하지 못해서 예상치 못한 다른 binding이 많을 수도 있다. 하지만 이후에 또 한번 PEG quality check를 했지만 문제가 없었다. 다른 이유는 Exosome loading의 scheme에 문제가 있는 것을 수도 있다는 것이다. 각 단계별로 다른 fluorophore를 붙여 형광을 통해 파악하고자 했다. 결과적으로 mCD63-Cy5와 Donkey-AF555의 Co-localization은 일어나지 않았다. 이후 각 항체의 농도를 다르게 하거나 사용하는 Fluorophore를 바꿔서 진행해봤지만 좋은 결과가 없었다.

Culture media에서 더 많은 Exosome을 추출할 수 있는 새로운 방법을 도입해 Exosome의 농도를 높여서 진행할 필요가 있다. 어느 정도 이상의 Exosome 개수가 image 상에 있어야 분석할 수 있다.

Conclusion

우리는 PEG이라는 물질을 Slide glass와 cover slip에 부착시켜 Chamber를 만들고, 원하는 물질을 잡아내는 실험을 진행했다. 그 중 Exosome을 잡기 위해 Exosome의 막 단백질 중 PD-L1을 target으로 하여 Ab와 Fluorophore를 처리했다. 사용한 Fluorophore와 만든 PEG slide의 quality가 보장이 되어야만 Data를 분석할 수 있기 때문에 먼저 quality check를 했다. 이어서 사용할 Exosome의 농도를 알기 위한 실험을 진행했다. 가장 먼저 사용한 Exosome sample의 농도는 정확히 알 수 없었고 실제 결과에서도 너무나 적은 수로 보였다. 초기의 계획에서는 Sample로 확실한 농도와 실험에 적절한 농도를 파악한 뒤, 다른 시료(Media나 전혈)로 확장하려고 했다. 하지만, Sample의 결과가 예상한 것과 달랐기 때문에 Culture media를 사용할 수 밖에 없었다. Media의 Exosome 농도를 높이기 위해 Extraction Kit를 사용했지만 여전히 낮게 나왔고, 다른 Fluorophore(Cy5)를 사용해 Co-localization을 확인했지만 결과는 좋지 않았다.

우리의 연구에서 개발한 Program을 통해 AF555의 one-to-one binding을 Photo-bleaching step 분석으로 check할 수 있었다. 그리고 Fluorophore의 적절한 농도를 찾았다. 실제로 Fluorophore quality check를 하는 실험에서는 Loading과 분석을 하는데 필요한 시간이 그렇게 길지 않았다. Exosome sample을 본 실험에서도 농도가 작아서 적게 보인 것이지 잡히지 않는 것이 아니었다. 이론상, Exosome의 막 단백질이 있고 특이적으로 결합할 수 있는 Ab를 처리하면 UC를 사용하지 않더라도 Exosome의 농도를 알고 실험에서 사용할 적절한 농도를 찾아서 Media에서 바로 Exosome을 잡는 것이 가능할 것이다. Media를 사용해서 볼 실험의 결과를 의미있게 만들기 위해서는 먼저 Media내 Exosome의 양을 늘릴 필요가 있다. 암세포에게 Drug처리나 UV와 같은 Cell stress를 주는 방법도 고려하고 있다. 향후 추가적인 연구를 통해서 전혈을 사용했을 때도 Exosome을 잡는 것이 가능하리라고 본다.

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