단일 시행(One-shot)으로 전혈에서 exosome을 추출/정제/정량적 으로 분석할 수 있는 자동화된 이미징 기반 기술 개발

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단일 시행(One-shot)으로 전혈에서 exosome을 추출/정제/정량적 으로 분석할 수 있는 자동화된 이미징 기반 기술 개발
제안자 이시은
자문교원 이종찬
연도 2020
타입 B형 과제
코스 프란시스 크릭
매칭여부 Yes
참여학생수 5
소개동영상

제안 배경

전 세계적으로 질병의 조기진단과 신약 개발을 위해, 혈액에서 RNA, 암세포, exosome 등의 물질을 검출하고 정밀진단하는 Liquid biopsy 연구가 활발하게 이루어지고 있다.1) 그 중, exosome은 cell-cell communication의 수단이다. Exosome은 한 세포의 DNA, RNA, 단백질, lipid 등을 다른 세포로 옮기는 중요한 수단으로, 암의 발생, 진행, 전이에 중요한 역할을 한다. 이런 이유로, 연구자들은 exosome을 중요한 바이오마커로써 연구하고 있다. 그러나, exosome을 추출하고 정량적으로 분석하는 방법은 아직 명확히 제시되지 않았다. 따라서, 새로운 분석법의 개발이 필요하다.

현재 가장 널리 사용되고 있는 exosome의 추출 및 분석 방법1)2)은 추출 단계와 분석 단계로 이루어져 있다. 먼저, exosome 추출/정제 단계에서는 혈액에서 혈장을 뽑고, Ultracentrifugation ( >100,000g)을 통해 exosome을 분리해낸다. 이때 프로토콜에 따라 대략 15시간에서 하루 정도의 시간이 소요된다. 비용이 많이 드는 ultracentrifugation 과정이 필요한 이유는 exosome의 크기가 매우 작아 (30-200nm) 다른 질량 기반 검출법의 사용이 어렵기 때문이다. 두 번째로는 분석 단계이다. 현재 이 단계에서는 Western blot 및 ELISA 등의 bulk assay가 이용되고 있다. 단일 exosome의 정량적 분석은 이 방법으로는 불가능하다. 따라서, 이 문제를 해결하기 위해서는 대량의 시료가 필요하다는 문제점이 발생한다. 이렇듯, 고비용의 ultracentrifugation 및 bulk 분석 방법은 각각의 문제점도 크지만, 추출/정제 단계와 분석 단계가 분리되어 따로 시행되어야 한다는 단점이 있다.

Exosome을 다루는 연구를 위해서는, Exosome이 microvesicle 등 다른 EV (extracellular vesicle)들과 분리되어야 한다. 이를 위해서는 Exosome이 맞는지, 해당 발현 단백질을 통해 확인하는 과정을 거쳐야 한다. 이 확인 과정 역시 한가지로 명확하게 제시되지는 않았으나, 현재 가장 널리 사용되는 방법은 a) CD9/CD63/CD81 중 하나의 막단백질의 enrichment, b) TSG101과 같은 endosomal/membrane-binding 단백질의 enrichment, c) AGO, HSP90B1과 같은 특정 세포 내 단백질의 미발현/저발현의 세 가지를 동시에 만족하면 exosome으로 판단하는 것이다. 따라서 이 경우 exosome을 깨지 않고는 현재 검출하고 있는 것이 exosome인지 확인하기 어렵다.

한 번의 샘플 loading으로 Exosome 추출/정제 및 정량적 분석까지 완료할 수 있는 (One-shot) 방법이 개발된다면 기존 방식의 문제점을 대부분 해결할 수 있다. 이러한 새로운 방법에 요구되는 특성들은

  1. Ultracentrifugation, 분석 등 옮기지 않고 한 번의 샘플 loading으로 추출/정제 및 정량적 분석을 완료 (One-shot),
  2. 단일 Exosome 각각을 정량적으로 분석할 수 있는 이미징 기반 기술
  3. 이미징 데이터를 바탕으로 분석 및 판단을 마칠 수 있는 소프트웨어 기술
  4. Exosome과 기타 EV들을 구분할 수 있는 기술,
  5. Exosome 특이적으로 표면흡착하고 다른 단백질들은 흡착하지 않는 기술

등으로, 기존의 방식으로는 충족되지 않는다. 따라서 위의 특성을 가진, 단일 시행으로 exosome을 추출/정제하고 정량적으로 분석할 수 있는 새로운 자동화된 기술이 필요하다.

과제 목표

  1. 최종 목표: 단일 시행(One-shot)으로 전혈(Whole blood)에서 exosome을 추출/정제하여 정량적으로 분석할 수 있는 자동화된 이미징 기반 방법의 개발
  2. 세부 목표
    • Exosome 관측용 TIRF/SRM 형광이미징 셋업
    • Exosome 추출/정제용 미세유체 챔버 프로토타입 설계 및 구현
      프로토타입 설계.png
    • 미체유체 챔버 클리닝 및 표면처리 프로토콜 확립
    • 최종 프로토타입 제작 및 테스트
    • 형광이미징용 exosome 식별 기준 정립 (크기, 바이오 마커)
    • 형광 이미징 바탕 머신 러닝을 이용한 자동화 분석 시스템 구축
    • 현장에서 One-shot으로 진단 가능한 키트 개발

과제 내용

본 과제에서는 전혈을 Ultracentrifuge하는 대신, 특수 표면처리된 미세유체 챔버에 흘려보내 exosome을 선택적으로 표면흡착시키는 방식을 이용한다. 표면이 충분히 exosome을 특이적으로 enrich할 수 있으면 혈액을 흘려보냄으로써 미세유체 챔버의 표면에 exosome을 추출/정제/부착할 수 있다. 이후 동일한 미세유체 챔버에서 워싱, 표지단백질 (PD-L1, CD24, Survivin, EGFRvIII 등)4) 형광표지 등이 syringe 펌프의 컴퓨터 조작을 통해 자동으로 진행된다. 이후 TIRF (total internal fluorescence) 및 SRM (super-resolution microscopy)를 이용하여 미세유체 챔버 표면의 exosome을 관측하고 이 데이터를 머신 러닝을 이용한 자동화 분석 시스템으로 분석하는 것을 골자로 한다. 모든 과정은 현미경 위에서 일어날 수 있기 때문에 ultracentrifugation 기반 방법과는 달리, 한 번의 sample loading으로 (One-shot) 추출/정제 및 정량적 분석을 동시에 할 수 있다. Work step.png

구체적인 과제 내용들은 다음과 같다.

  1. Exosome 관측에 특화된 TIRF 및 SRM 현미경의 확보 및 셋업: Exosome 관측에 특화된 현미경을 확보하고 필요시 셋업한다. Exosome의 크기가 광학 분해능보다 작기 때문에 TIRF 및 SRM의 강점이 도드라진다. TIRF의 경우 표면만 illumination하기 때문에 Exosome과 기타 EV를 구분하는 데 큰 도움이 될 것이며, SRM의 경우 exosome의 막단백질의 초고분해능 이미징이 가능하다.
  2. 미세유체 챔버 프로토타입 설계 및 구현: 일반적인 미세유체 챔버는 PDMS와 같은 Soft material로 만들어지는 경우가 많으나 본 과제에서는 Non-specific binding을 극단적으로 줄이기 위해 유리 및 Quartz를 이용하여 표면처리 자유도를 높인다. 챔버 프로토타입은 exosome을 enrich하기 좋은 형태로 디자인된다.
  3. 표면 클리닝 및 표면처리 프로토콜 확립: 특수 표면처리는 exosome을 특이적으로 부착시킬 수 있는 CD9/CD63/CD81 항체를 가지고 있어 exosome만 enrich하고 그 외 모든 단백질들은 부착시키지 않는 low non-specific binding 표면처리이다. 이를 위해 좋은 표면 클리닝이 필요하다. 본 과제에서는 단분자 생물물리의 보편 프로토콜 외에 Propane burning, Piranha 클리닝, 플라즈마 클리닝 등을 테스트하여 표준 프로토콜로 확립할 것이다. 또한 표면처리를 위해 다양한 물질들(PEG, DT20, etc.)5)을 테스트하여 가장 효율이 좋은 passivation 물질을 찾는다.
    Surface passivation.png
  4. 최종 프로토타입 제작 및 테스트: 미세유체 챔버를 구현하고 표면처리 기법을 확립한 후 프로토타입을 제작하고 효율화한 후 이를 테스트한다. 먼저 기존의 방식대로 Ultracentrifugation을 통해 추출된 Exosome을 테스트하여 유효성을 검증한다. 다음 단계로 cell culture에 사용한 buffer를 시료로 하여 release된 exosome을 관찰한다. 세포가 생장하면서 수많은 단백질들을 분비하기 때문에 이전 단계의 시료보다 biomolecule의 농도가 높다. 그 다음 단계로 1차 centrifuge를 하여 혈구를 걸러낸 blood plasma를 이용해 실험을 진행한다. 최종적으로는 Whole blood를 이용해 실험을 진행하여 우리가 고안한 slide coating 물질에 의해 exosome을 높은 효율의 특이성을 보이며 한 번에 분리해낼 수 있는지 확인한다.
  5. 형광이미징용 exosome 식별 기준 정립 (크기, 바이오 마커): 기존의 Exosome을 깨뜨려서 관측하는 Western blot, ELISA 기술과 다르게 본 과제의 이미징 기반 기술은 exosome을 깨뜨리지 않고 exosome을 식별할 수 있다. 특히 TIRF 현미경 기반 exosome 식별은 exosome과 microvesicle을 구별하는 데 크기 뿐 아니라 Morphology도 달라질 수 있다. 크기가 큰 MV의 경우 TIRF에 의해 전체가 illuminate되지 않기 때문에 원형이 아니라 반원형으로 관측되기 때문이다. 또한 SRM을 exosome의 막단백질 분포를 알려주기 때문에 이에 기반한 새로운 식별 기준 정립이 요구된다. Exosome에 enrich되는 혹은 exclude 되는 biomarker들 중 선별하여 collocalization 기반 판별 기준을 정립한다.
  6. 형광 이미징 바탕 머신 러닝을 이용한 자동화 분석 시스템 구축: 이렇게 확보된 Data는 디지털화 되어 있기 때문에 머신 러닝을 이용한 자동화 분석 시스템을 구축할 수 있다. 이를 통해 One-shot으로 한 번의 샘플 로딩을 통해 최종적인 분석 혹은 진단까지 구현할 수 있다. 본 과제에서는 파이썬 기반 머신 러닝 Open library를 이용하여 형광 이미징 분석 자동화를 할 계획이다.
  7. 현장에서 One-shot으로 진단 가능한 키트 개발: 클리닝 되고 표면처리된 미세유체 챔버 및 샘플 로딩용 튜브, 이미징 분석 소프트웨어 등을 묶어 하나의 키트로 만들어 TIRF/SRM 현미경 위에 올린 상태로 One-shot으로 진단 가능한 패키지를 만든다.

참고자료

1) Chen, G., Huang, A. C., Zhang, W., Zhang, G., Wu, M., Xu, W., . . . Guo, W. (2018). Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response, Nature VOL 560, 382 – 403.

2) Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., & Laktionov, P. P. (2018). Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed research international, 2018, 8545347. doi:10.1155/2018/8545347

3) Yu, L.-L., Zhu, J., Liu, J.-X., Jiang, F., Ni, W.-K., Qu, L.-S., … Xiao, M.-B. (2018). A Comparison of Traditional and Novel Methods for the Separation of Exosomes from Human Samples. BioMed Research International, 2018, 1–9. https://doi.org/10.1155/2018/3634563

4) Soung, Y. H., Ford, S., Zhang, V., & Chung, J. (2017). Exosomes in Cancer Diagnostics. Cancers, 9(1), 8. doi:10.3390/cancers9010008

5) Hua, B., Han, K. Y., Zhou, R., Shi, X., Abeysirigunawardena, S. C., ... Ha, T. (2014). An improved surface passivation method for single molecule. Nature methods VOL 11 No. 12, 1233 - 1236.

희망학생

이시은(seanee1218@dgist.ac.kr), 전수현, 정민찬, 황대원