인간유도만능줄기세포를 뇌세포 및 뇌오가노이드로 보다 손쉽고 저렴한 비용으로 분화시키는 방법의 개발

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인간유도만능줄기세포를 뇌세포 및 뇌오가노이드로 보다 손쉽고 저렴한 비용으로 분화시키는 방법의 개발
Year 2020
Title 인간유도만능줄기세포를 뇌세포 및 뇌오가노이드로 보다 손쉽고 저렴한 비용으로 분화시키는 방법의 개발
Authors 유지영, 정유진, 조가연
Abstract As a part of brain research and treatment of degenerative brain diseases, studies to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into brain cells are being actively conducted. However, because the required cost is enormous, commercialization is still impossible. Therefore, the goal is to make the cost cheaper by finding substitutes for growth factors necessary for differentiation. We studied the possibility of cholesterol as a substitute for sonic hedgehog (Shh) required to differentiate into dopaminergic neurons that can be used for the treatment of Parkinson's disease. Six groups containing different concentration of Shh and cholesterol were used to differentiate iPSCs by the 11th day. And each group was compared by performing immunocytochemistry, filipin III staining, and qPCR. As a result, it was difficult for cholesterol to completely replace Shh, but it was possible to supplement it. In addition, from the experimental results, we confirmed the interesting fact that cholesterol increases during the process of differentiation with Shh condition, which is not well known yet. Therefore, differentiation can be promoted or inhibited by cholesterol control.
Keywords Parkinson's Disease, Sonic Hedgehog, Cholesterol, human induced pluripotent stem cell, Dopaminergic neurons

Introduction

인간유도만능줄기세포를 뇌세포 및 뇌오가노이드로 보다 손쉽고 저렴한 비용으로 분화시키는 방법의 개발
제안자 서진수
자문교원 서진수
연도 2020
분류
타입 A형 과제
코스 장영실
매칭여부 Yes
참여학생수 3
소개동영상

다른 신체 장기와 달리 뇌는 연구 수행을 위하여 그 안을 들여다보거나 살아있는 상태의 조직을 얻기가 쉽지 않다. 인구의 고령화에 따라 퇴행성뇌질환을 겪는 환자의 수가 급격하게 증가하고 있는 현대 사회에서, 치료제 개발을 위해 환자의 뇌조직 혹은 세포가 연구에 활용되는 것이 이상적이지만 이러한 한계로 인하여 많은 연구들이 실험동물모델에 의존하게 된다. 물론 실험동물모델이 많은 장점을 가지고 있지만, 관찰된 결과를 사람의 유전체 시스템에서 재확인 함으로써 그 기능의 검증과 함께 부작용이 없음을 확인하는 단계가 필요하다. 이러한 관점에서 인간뇌모델은 그 필요성이 제기된다.

마침 2006년도에 개발된 '인간유도만능줄기세포 변환기술'은 사람의 피부세포를 포함한 체세포를 줄기세포로 전환시킨 후, 이를 다시 뇌세포로 분화시킬 수 있는 방법을 제시하였다. 본 연구자는 이를 활용하여 알츠하이머성 치매 환자의 체세포로부터 뇌세포 및 미니뇌 (뇌오가노이드)를 만들었고, 이 인간 모델 시스템에서 알츠하이머성 치매 환자의 뇌에서 나타나는 병변들이 잘 표현된다는 것을 관찰하였다. 이를 바탕으로 현재 본 연구자는 알츠하이머성 치매의 병리 기전을 밝히고 치료제를 개발하는데 인간유도만능줄기세포를 적극 활용하고 있다. 궁극적으로 환자의 체세포를 직접 연구에 활용하게되면 개인별 병리적 원인의 다양성을 바탕으로, 그리고 치료제에 대한 저항성 및 효과 차이를 해소할 수 있는 맞춤형 치료제의 개발이 가능하다. 또한 3대 노인성 질환으로 알려진 파킨슨병의 치료에도 활용될 수 있다. 실제로 2017년 논문에 따르면, human iPS cell-derived dopaminergic progenitor cells를 파킨슨병을 앓는 영장류 모델에 이식했을 때, midbrain dopaminergic neurons(mDA)로 살아남았고 파킨슨병의 증상이 완화되는 것을 확인했다. 즉 환자에게서 유래한 iPSCs를 dopaminergic progenitor cells로 분화시켜 이식하면 파킨슨병을 완화 혹은 치유할 수 있다.

하지만 가장 큰 장애로 작용하는 요인 중 하나는 바로 비용이다. 인간유도만능줄기세포의 뇌세포 및 뇌오가노이드 분화를 위해 많은 성장인자들이 사용되고 있는데 이는 막대한 비용을 발생시킨다. 이러한 이유로 실제 임상으로 적용되는 경우, 환자들에게는 상당한 치료비용이 요구된다. 실제로 최근 일본에서 시도되었던, 환자의 인간유도만능줄기세포를 이용한 각막제작 및 이식 비용은 약 10억원이나 되었다. 위에서 언급된 파킨슨병의 치료법으로 제안된 환자의 iPSCs를 mDA로 분화시키는 과정에 필요한 성장인자도 굉장히 큰 비용이 필요하다. 그 효과는 입증이 되었지만 비용에 의해 상용화가 될 수 없다는 장벽이 있다. 따라서 치료법의 효과가 입증된 iPSCs를 mDA로 분화시키는 과정에 필요한 성장인자의 대체재를 찾아 비용에대한 장벽을 낮추어 최종적으로 상용화시키는 가능성을 높이는 것이 이번 연구의 목표다.

우리는 먼저 파킨슨병 환자의 iPSCs를 mDA로 분화시키는 데에 필요한 성장인자들의 역할을 조사하고, 대체가 필요한 물질들의 후보를 탐색했다. 대표적으로 많은 비용이 필요한 것이 sonic hedgehog(Shh)와 FGF8b였다. 이들을 대체할 수 있는 화학적 물질, 물리적 조절 등 다양한 방법을 탐색하던 중, cholesterol이 Shh 물질을 대체할 가능성을 보여주는 두 가지 선행연구를 발견할 수 있었다. Deshpande, I., et al. (2019)에서는 membrane sterols이 smoothened(SMO)를 자극하여 Hedgehog pathway를 활성시킬 수 있다는 가능성을 보여주었고, Huang, P., et al. (2016)에서는 cellular cholesterol이 hedgehog signaling에서 직접적으로 SMO를 활성시킨다는 것을 보여주었다. 두 가지 논문은 cholesterol이 mDA 뉴런 분화 과정에 필요한 Shh signaling pathway를 자극 및 활성화시켜 Shh를 대체할 수 있을 것이라는 가설의 근거가 되었다. 따라서 이 가설을 인간유도만능줄기세포에 적용하고 그 결과 생성된 세포의 생리적 기능을 포함한 성격을 검증함으로써 뇌세포로 분화되었음을 확인하고자 했다. 먼저 cholesterol이 mDA 뉴런 분화 프로토콜에 필요한 Shh를 대체하거나 혹은 적은 양의 Shh를 사용하였을 때 보완할 수 있는지 확인하기 위해 실험을 진행했다. 덧붙여 cholesterol 단독 처리는 cell의 uptake 효율성이 낮을 것을 대비해, 세포막으로 전달될 수 있도록 매개체인 MbCD와 cholesterol을 합쳐서 사용하였다.

Cell replacement therapy.jpg


Method

도파민성 뉴런으로의 인간유도만능줄기세포 분화

사람에게서 유래된 인간유도만능줄기세포를 0.35 X 10^6 density/well로 seeding 하고, 약 48시간 후 well의 70% 정도로 증식하면 분화를 시작한다. 0일부터 10일까지 분화를 진행했고 11일차에 면역세포화학(ICC) 염색과 Filipin 염색을 진행하였다. 매일 배양액을 교체했으며 0일부터 4일까지는 Knock-out serum replace (KSR)-based medium을 사용했다. 5일부터 이틀 간격으로 N2-based medium의 비율을 점차적으로 늘려 75%의 N2-based medium과 25% KSR-based medium의 조성의 배양액을 사용했다. 각 날짜마다 배양액에 첨가되는 물질들은 아래 Figure 2와 같고 Sonic Hedgehog(SHH)와 Purmorphamine, Cholesterol의 양은 실험 조건에 따라 다르다. SB431542는 10mM, LDN-193189는 1mM, CHIR99021은 10mM, FGF8b는 50ug/ml, Purmorphamine은 10mM이 첨가되었다. 실험조건은 총 6가지로 1. SHH를 첨가하지 않은 조건 (Control) 2. Shh를 50ug/ml 첨가한 조건 (Shh Half) 3. Shh를 100ug/ml 첨가한 조건 (Shh Full) 4. Cholesterol 40uM을 첨가한 조건 5. Shh 50ug/ml와 Cholesterol 40uM을 첨가한 조건 (Shh Half + Chol 40) 6. Shh 100ug/ml와 Cholesterol 40uM를 첨가하고 Purmorphamine(Pur)을 첨가하지 않는 조건이다.

Dopaminergic neuron differentiation_ Modified by SC


면역세포화학(Immunocytochemistry) 염색

항체를 이용해서 세포 내 특정 물질의 존재 부위를 확인하기 위한 염색법이다. 염색하고자 하는 세포를 Paraformaldehyde (PFA)로 고정하고 Phosphate Buffered Saline (PBS)로 washing 후 50ul의 Blocking solution을 넣어 실온에서 1시간 기다린다. Primary antibody를 적절한 농도 (1:200)로 희석한 후, Parafilm 위에 약 20ul 도포한다. well에서 coverslip을 꺼내 primary antibody위에 세포가 위치하도록 덮고 빛을 차단하여 실온에서 1시간 30분간 shaking한다. PBS로 5분씩 3번 washing후 Secondary antibody를 적절한 농도 (1:500, Hoechst는 1:1000)으로 희석한다. FOXA2는 Goat 594 (red), LMX1은 Rabbit 488 (green), 핵 염색은 Hoechst (blue)를 사용하였다. secondary antibody를 well에 250ul씩 넣은 후 호일로 감싸 빛을 차단한 상태로 1시간 반응시킨다. PBS로 3번 washing한 후 mounting media인 Vecta shield로 고정 및 매니큐어로 실링 후 Confocal imaging을 진행했다.

Filipin III 염색

세포에 있는 cholesterol의 존재를 확인할 수 있는 염색법이다. PBS로 3번 washing 후 fixative solution을 well당 200ul씩 넣어 shaker에서 60rpm으로 10분 반응시킨다. 다시 PBS로 5분씩 3번 shaker에서 washing한다. filipin III를 1:200의 농도로 희석한 후 well당 200씩 넣고 37도 65rpm에서 shaker에서 1시간 동안 반응시킨다. 빛을 차단한 상태에서 PBS로 2~3번 5분간 shaker에서 washing한다. Vecta shield로 고정 및 매니큐어로 실링 후 Confocal imaging을 진행했다.

실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)

세포 안의 목표 DNA분자를 증폭하고 그 양을 정량적으로 측정할 수 있는 방법이다. 먼저 세포에서 RNA 추출, 분리과정을 거친 후 RNA 농도를 측정하고 희석한다. cDNA를 합성한 후 목표로 하는 Gene의 primer를 이용해 qPCR을 진행한다. 여기서는 Shh pathway의 read-out 대상으로 Gli1 primer를 제작하여 사용했다.

Result

  • cholesterol 농도 선정
분화 실험을 진행하기 전 적절한 cholesterol 농도 조건을 선정하기 위해 cholesterol 농도를 달리하여 iPSC 및 NPC에 4일 간 처리하고 culture를 진행하였다. 먼저 iPSC에 cholesterol 40uM, 80uM, 100uM, 250uM 농도 조건으로 media를 조성하여 culture하고 Gli1 mRNA 발현량에 대한 qPCR 결과를 비교하였는데 모든 농도 조건에서 큰 차이를 보이지 않았다. 다만 cholesterol 80uM 이상의 농도로 처리한 조건에서는 cell death가 많이 관찰되었다. 이후 NPC에 cholesterol 20uM, 40uM, 80uM, 100uM 농도 조건으로 media를 조성하여 culture하고 Gli1 mRNA 발현량에 대한 qPCR 결과를 비교하였는데 cholesterol 80uM 조건에서 가장 발현량이 높았으며, 그 다음으로는 100uM, 40uM, 20uM 순으로 높았다. 그렇지만 NPC 실험에서도 cholesterol 80uM 이상의 농도로 처리한 조건에서는 cell death가 많이 관찰되었다. 실제 분화 프로세스 상에서는 Shh의 처리 기간이 4일보다 긴 것을 고려하여 cell death가 일어나지 않은 농도 중 Gli1 mRNA 발현량이 높게 나타난 cholesterol 40uM을 분화 실험에서 사용할 cholesterol 농도로 선정하였다.
  • LMX1, FOXA2 double positive
ICC double positive.png


(c)는 분화 시작 후 11일 된 iPSC cell을 immunocytochemistry로 LMX1, FOXA2, Hoechst에 대해 staining한 뒤 confocal 현미경으로 관찰한 결과이다. 여기서 Hoechst는 blue signal로 nucleus 영역을 확인할 수 있고, LMX1은 green signal, FOXA2는 red signal로 각각의 발현 area 및 intensity를 확인할 수 있다. (a)와 (b)의 그래프는 (c)와 같은 confocal image들을 Fiji로 분석하여 수치화한 것이며, control 값을 1로 설정하여 상대값으로 나타내었다.
(a)와 (b)의 그래프를 확인하면, cholesterol 40uM을 포함한 세 가지 조건 모두 control 대비 2배 이상 높은 area값을 가졌다. 그리고 Shh full 처리 조건과 비교했을 때 Shh half 조건도 어느 정도 비슷한 area 및 intensity값으로 나타났다. Shh half+cholesterol 40uM 조건과 Shh full+cholesterol 40uM w/o Pur 조건의 경우 cholesterol이 Shh와 그 agonist인 Pur 중에서 어떤 것의 역할을 대체할 수 있는 지를 확인하기 위해 실험한 것인데, 두 조건의 area 및 intensity가 상당히 비슷한 값으로 나타났다.
  • Filipin III staining
Filipin III staining analysis.png


(b)는 분화 시작 후 11일 된 iPSC cell을 cholesterol의 분포를 보기 위해 filipin III staining한 뒤 confocal 현미경으로 관찰한 결과이다. blue signal을 Fiji로 분석하여 area 및 intensity값을 확인하였으며, (a) 그래프에서는 area 및 intensity의 곱으로 계산 후 control 값을 1로 설정하여 상대값으로 나타내었다.
filipin III staining은 cholesterol 분포를 보는 실험임에도 cholesterol 처리 조건이 아닌 Shh 처리 조건에서 그 값이 월등히 높게 나타났다. cholesterol 40uM만 처리한 조건은 control 조건과 비슷한 수준으로 나타났으며, cholesterol 40uM을 포함하고 있는 세 조건 중에서는 Shh full+cholesterol 40uM w/o Pur 조건이 area 및 intensity 값 모두 가장 높았다. Shh 처리 조건은 처리 농도에 거의 비례하는 경향성을 보였다.
  • qPCR
QPCR.png


Shh signaling pathway에 대한 효과 탐색을 위해 read-out으로 선정되었던 Gli1 mRNA에 대해 제작한 primer A, B를 사용하여 qPCR을 진행하였고, (a)에서 각각의 값을 control을 1로 설정하여 상대값으로 나타내었다. qPCR 결과는 filipin III staining 결과와 비슷한 경향성을 보였다. Shh full 처리 조건에서 가장 발현량이 높았으며 Shh half 조건이 그 다음으로 나타났다. cholesterol 40uM만 처리한 조건은 control 조건과 비슷한 수준으로 나타났으며, cholesterol 40uM을 포함하고 있는 세 조건 중에서는 Shh half+cholesterol 40uM 조건이 가장 발현량이 높게 나타났다.

Discussion

mDA 뉴런으로 분화된 double positive 뉴런이 차지하는 area 비교 그래프에서 control 대비 cholesterol 40uM이 약 2.5배 증가했다. Shh를 처리했을 때의 효과보다는 약하지만, cholesterol이 mDA 뉴런의 분화를 촉진하는 데에 영향성을 가진다고 생각할 수 있다. 하지만 Shh half와 Shh half+cholesterol 40uM 결과를 비교해보면 cholesterol을 추가함으로 오히려 효과가 줄어들었다. 쉽게 생각하면 Cholesterol이 Shh의 효과를 약화시키는 것처럼 보인다. 하지만 MbCD가 콜레스테롤을 용해시키는 경향성을 가지기 때문에, cholesterol을 cell에게 전달하기 위해 사용한 MbCD가 오히려 분화 촉진 효과를 떨어트렸을 수 있다. 이를 뒷받침하는 근거를 filipin III staining 결과에서 확인할 수 있었다. Filipin III staining 결과, Shh를 처리한 그룹에서 굉장히 강한 신호가 관찰됐다. 즉 Shh를 통해 mDA 뉴런으로 분화할 때 cholesterol의 양이 증가한다는 사실을 알 수 있다. 따라서 MbCD 없이 cholesterol을 단독처리 했을 때 분화에 미치는 영향성을 확인하면 좀 더 정확하게 cholesterol의 대체 혹은 보조 가능성에 대하여 연구할 수 있을 것이다. 덧붙여 mDA 뉴런 분화과정 중 세포 내 cholesterol이 증가하는 것은 기존에 잘 알려지지 않은 사실이다. 따라서 MbCD 등의 물질이나 CRISPR-Cas9 등의 기술을 이용하여 cholesterol 발현을 조절하는 것이 분화에 영향성을 미치는가에 대한 추가적인 연구가 필요하다. 만약 cholesterol 발현양이 분화와 연관성이 있다면, 좀 더 쉽게 분화를 촉진하거나 혹은 반대로 억제하는 방향으로 이를 이용할 수 있을 것이다.

Reference

Deshpande, I., Liang, J., Hedeen, D., Roberts, K. J., Zhang, Y., Ha, B., ... & Myers, B. R. (2019). Smoothened stimulation by membrane sterols drives Hedgehog pathway activity. Nature, 571(7764), 284-288.

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