인간 질병 실시간 모니터링을 위한 마이크로플루이딕스 기반 통합 액체 생검 분리기술 개발

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인간 질병 실시간 모니터링을 위한 마이크로플루이딕스 기반 통합 액체 생검 분리기술 개발
제안자 박연수
자문교원 김민석
연도 2020
타입 B형 과제
코스 장영실
매칭여부 Yes
참여학생수 5
소개동영상

제안 배경

Abstract

  • 액체 생검 분야는 조기 진단, 질병 경과 모니터링, 맞춤형 최적 치료 약물 선정, 등 지금까지 구현되기 어려웠던 의공학적 검출 기술의 가능성을 보여주고 있어 최근 가장 주목받고 있는 진단법 중 하나임
   이승준.png
   그림 1. 혈액 기반 액체 생검 시료의 실제와 활용
  • 인간의 조직을 떼어내어 일시적인 시점에 질병을 검사하는 조직 검사와 달리, 액체 생검은 체액 (땀, 오줌, 혈액, 침)에서 쉽게 얻을 수 있는 시료로서, 비침습적으로 건강 상태 및 질병 모니터링 및 진단이 가능함. 뿐만 아니라, 인류를 가장 위협하고 있는 Cancer 조기 진단 및 환자 맞춤형 치료 약물 선정에도 활용 가능해 액체 생검의 기술적 가치와 파급효과는 매우 큰 것으로 평가받고 있음
  • 액체 생검의 타겟으로 혈중 희귀 세포 (Circulating rare cells), 혈중 DNA (cfDNA), 엑소좀 (Exosome) 이 주로 활용됨. 이 생체시료들은 모두 매우 극 저농도로 존재하고, 비균질적인 양상 때문에 고순도로 고효율 분리가 쉽지 않은 상황임
  • 개별 액체 생검 시료 분석은 기존방법이 접근하지 못했던 진단 및 치료의 핵심 정보를 얻을 수 있어 가치가 높지만, 맞춤형 치료, 정밀의학을 위해서는 각 의료정보의 통합적인 해석이 필요함
  • 현재 기술은 액체 생검의 단일 시료를 분리하는데 국한 되어 있는데, 액체생검 내 여러 핵심 타겟 시료를 동시에 분리하고 각 액체 생검의 단점을 보완하여 총체적으로 분석할 수 있는 플랫폼이 있다면, 암의 조기진단, 전이 예측, 약물 저항성 극복 치료, 잠복 후 거대전이 예측 치료 등 암 치료의 주요 문제점을 해결할 수 있을 것임. 이 통합 액체 생검 분리기술은 미래 핵심 의공학 기술의 지표로서, 정밀 진단과 맞춤형 치료의 근간이 될 것임
  • UGRP 도전 과제인 “통합 액체 생검 분리기술 (Multi-functional liquid biopsy isolation technology) 개발”은 창의성 및 도전성을 바탕으로, 개념증명 단계에서부터 기술개발, 임상시료를 활용한 검증까지 경험해 볼 수 있어 과학기술의 임상적 활용에 관심을 두는 학생에게 큰 도움이 될 것임

과제 목표

  • 혈액 기반 액체 생검 타겟 물질 동시 분리를 위한 미세유체제어기술을 개발하고, 진단과 동시에 치료를 위한 면역세포 분리가 가능한 통합 플랫폼 개발

과제 내용

도전과제를 통해 달성하고자 하는 세부 목표는 다음과 같음

1. 원심미세유체 (Centrifugal microfluidics) 기술 리뷰 및 미세유체 디바이스 설계

  • 액체 생검의 효과적인 분리 핵심 기술 중 하나인 원심 미세유체의 원리와 최신 기술 동향에 대한 심층 이해 (그림 2. 참조)
  • 액체 생검 시료 ctDNA, 혈중 희귀세포 (순환종양세포), 엑소좀, 혈소판 (Platelet)에 대한 세포 생물학적 이해, 임상 활용에 대한 리뷰 (그림 2. 참조)
  • 암 진단 및 치료를 위한 혈액 기반 액체 생검 분석 결과 해석 및 활용 방법에 대한 포괄적 이해
  • 미세유체 디바이스 설계를 위한 CAD, CAM의 기본 이해
본 연구실이 보유하고 있는 원심미세유체 기술 기반 CTC 분리 플랫폼

2. 미세유체 디바이스 원리 검증 및 특성평가

  • 물리적 특성 (크기, 밀도) 및 생물학적 특성 (바이오마커)을 활용한 분리 기술 원리 의 개념 증명 검증
  • 혈액 내 각 액체 생검 타겟 시료의 일차 분리 (전혈, 혈장, PBMC) 원리 및 분리 기술 특성 평가
  • 분리한 혈장 유래 ctDNA, 엑소좀, 혈소판, PBMC 유래 순환종양세포 및 면역세포 검증
   이승준1.png
   그림 2. 액체 생검 분리 미세유체 기술의 실제와 응용  

3. 실제 혈액 샘플 기반 액체 생검 타겟 물질 분리 및 효율 검증

  • 일반 혈액 내 액체 생검 타겟 물질의 분리 효율 검증을 위한 in vitro model 구축
  • 환자 혈액 기반 ctDNA, 엑소좀, 순환종양세포, 혈소판의 분리 및 분리 효율 검증
  • 기존 분석법 기반, 분리한 각 액체 생검 시료의 임상 정보 및 가치 비교 검증
  • 실제 임상에서 활용 가능한 플랫폼으로 적용, 검증, 응용 확장성을 위한 제고

주제의 특성 상 바이오칩의 개발과 제작, 평가에 있어 현실적인 계획 수립이 필요할 것임.

이에 해당 도전과제를 2년에 걸친 장기 프로젝트로 기획, 연차별 핵심 과제를 아래 표로 정리함.

2020 UGRP 중장기 계획 v2.png

참고자료

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  3. Mader, K. Pantel, Liquid Biopsy: Current Status and Future Perspectives. Oncol Res Treat 40, 404-408 (2017).
  4. J. M. Park et al., Fully automated circulating tumor cell isolation platform with large-volume capacity based on lab-on-a-disc. Anal Chem 86, 3735-3742 (2014).
  5. C. Alix-Panabieres, K. Pantel, Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discov 6, 479-491 (2016).
  6. B. M. Szczerba et al., Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature 566, 553-557 (2019).
  7. Neoh, K. H., Hassan, A. A., Chen, A., Sun, Y., Liu, P., Xu, K. F., ... & Han, R. P. (2018). Rethinking liquid biopsy: Microfluidic assays for mobile tumor cells in human body fluids. Biomaterials, 150, 112-124.
  8. Sun, Y., Haglund, T. A., Rogers, A. J., Ghanim, A. F., & Sethu, P. (2018). Microfluidics technologies for blood-based cancer liquid biopsies. Analytica chimica acta, 1012, 10-29.
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  10. Neoh, K. H., Hassan, A. A., Chen, A., Sun, Y., Liu, P., Xu, K. F., ... & Han, R. P. (2018). Rethinking liquid biopsy: Microfluidic assays for mobile tumor cells in human body fluids. Biomaterials, 150, 112-124.
  11. Sun, Y., Haglund, T. A., Rogers, A. J., Ghanim, A. F., & Sethu, P. (2018). Microfluidics technologies for blood-based cancer liquid biopsies. Analytica chimica acta, 1012, 10-29.
  12. Neoh, K. H., Hassan, A. A., Chen, A., Sun, Y., Liu, P., Xu, K. F., ... & Han, R. P. (2018). Rethinking liquid biopsy: Microfluidic assays for mobile tumor cells in human body fluids. Biomaterials, 150, 112-124.
  13. Laxmi, V., Tripathi, S., Joshi, S. S., & Agrawal, A. (2018). Microfluidic techniques for platelet separation and enrichment. Journal of the Indian Institute of Science, 98(2), 185-200.
  14. Xu, Z., Qiao, Y., & Tu, J. (2019). Microfluidic Technologies for cfDNA Isolation and Analysis. Micromachines, 10(10), 672.
  15. Le Saux, G., & Schvartzman, M. (2019). Advanced Materials and Devices for the Regulation and Study of NK Cells. International journal of molecular sciences, 20(3), 646.

희망학생

박연수(제안자)(medullapark@dgist.ac.kr)

김동균

김태형

김지윤

고지연


안녕하세요, 주제 제안자 박연수입니다.

평소 중개의학, BioMEMS, 의공학, liquid biopsy, microfluidics 분야에 관심이 있거나 배우고 싶은 학생들과 함께 연구하고자 합니다.

암을 비롯한 인간 질병을 실시간으로 간단하게 모니터링할 수 있는 바이오칩 개발을 목표로 하고 있습니다.

주제에 관심이 있거나 함께 공부하고자 하는 분들은 언제든지 연락해주시면 감사하겠습니다.

또한 해당 문서에 할당된 토론 페이지에서 여러분의 의견을 적극적으로 남겨주시면 함께 지식을 교류할 수 있는 장으로 발전시키도록 하겠습니다.


연락처: (박연수) medullapark@dgist.ac.kr

연구실 E5-313


추가 상세 설명

해당 도전과제의 주제 구체화 과정에 있어 조사한 참고 자료를 아래 첨부합니다.

기본적인 내용은 제안자 본인(박연수)과 자문교원이 뼈대를 세웠지만, 자료의 조사와 구성에 있어서는 주제에 관심을 가진 학생들이 문서에 할당된 토론창에 게시한 의견을 적극 반영하였습니다.

학생들이 직접 공부하고 제안을 낸 내용은 해당 토론창에 보다 자세하게 기술되어 있습니다.

액체 생검의 정의 및 잠재적 가치

액체 생검의 종류와 적용 분야
피 한 방울로 우리 몸 상태를 모두 엿볼 수 있는 시대가 올까? 암을 조기에 진단하는 것은 물론이고, 다양한 질환을 앓고 있는 환자의 병리, 생리적 상태를 실시간으로 정확하게 모니터링 할 수 있을 것이다. 현재의 치료 전략 시스템으로도 치료 접근 가능한 선택지가 훨씬 많아지고, 치료가능 확률도 높아질 것이다. 이러한 모니터링을 가능케 하는 수단으로 우리 몸 어디에나 존재하는 체액이 생검 및 분석 시료로서 많은 주목을 받고 있다. 이에 따라 최근 액체 생검(liquid biopsy) 기반 진단기술 및 이를 임상치료에 활용하기 위한 연구 개발이 활발하다.
액체 생체검사(액체 생검, liquid biopsy)는 혈액을 비롯해 신체 부위별로 존재하는 체액 내 시료로부터 인체 내 생리활성, 대사 작용 및 질병의 변화를 예측하기 위한 분석검사를 말한다. 분석에 활용 가능한 체액은 혈액에서부터 뇌척수액, 침, 객담, 흉막삼출액 및 기관지 세척액, 자궁경부 도말표본 (pap smear), 분변, 눈물, 땀, 소변에 이르기까지 다양하다. 체액의 임상적 가치는 이미 오래전부터 주목받아왔다. 최근 체액 내에 낮은 농도로 존재하는 핵산, 단백질 및 특정 세포들을 분리, 검출하는 기술의 발전과 전유전체 염기서열 분석법(WGS), 차세대 염기서열분석법(NGS), 단일세포 분리 및 분석법의 발달 등으로 생검 내 시료를 검출 분리하고 분석할 수 있게 됨으로써, 상대적으로 비침습적인 방법으로 채취한 액체생검의 중요성이 더욱 주목받고 있다.
액체 생검은 이미 2015년 MIT 테크놀로지 리뷰가 선정만 미래유망기술로 예측된 바 있고, 최근에는 액체생검 기반 폐암 진단법이 FDA의 승인을 받기에 이르렀다. 2020년 글로벌 시장에서 액체 생검 관련 산업이 1 조원에 이를 것으로 추산되고 있다.
암의 경우, 원발병소의 위치, 전이된 암의 이질성, 종양 내 비균질성(intratumoral heterogeneity)은 암 치료의 큰 장벽이 되는 항암제 내성, 전이, 재발의 주요 원인이 된다. 고형암의 경우, 상피 암세포, 간엽세포, 암 줄기세포 등의 이질적인 세포군을 포괄적으로 분석해야 함에도 불구하고 현재의 표준 진단법인 조직 생검(tissue biopsy)은 국소적으로 제한적인 조직 시료를 채취하여 분석함으로써 종양 내 비균질적인 세포군과 물리적, 환경적 미세환경과의 상호작용을 모두 고려하기에는 한계가 있었다. 

액체 생검은 체액 내 존재하는 암세포 유래 ctDNA(circulating tumor DNA), 엑소좀(exosome), 순환종양세포(circulating tumor cells, CTCs) 등으로부터 유전체, 전사체 및 단백체를 분석하고 바이오마커 유무를 측정함으로써, 최적의 시공간적 단계에서 좀 더 포괄적이고 정확한 병리, 생리적 정보를 제공할 수 있다. 이는 환자의 유전체 기반 맞춤형 의학, 정밀의학으로 진화하고 있는 임상 중개의학의 기조와 맞닿아 있다.

액체 생검의 종류와 시료

액체 생검의 종류
인체 내 존재하는 모든 체액은 생검으로서의 개별적 가치가 있고 체액 내 핵산, 단백질, 종양세포 등이 분석시료로서 활용된다. 하지만, 기타 체액은 다양하게 낮은 농도로 존재하고, 표준화된 검출법 및 분리 기술이 아직 검증단계에 있으며, 기존의 의료기술과 설비, 분석 기반 기술을 활용하기에는 혈액이 그 중에서도 최적의 시료이다. 비세포성 DNA(cell free DNA, cfDNA)인 ctDNA, 순환종양세포, 순환종양 RNA 종, 세포외소포(엑소좀 및 분비성 미세소포)가 액체 생검의 주요 분석 시료가 된다.
혈액 이외에 뇌척수액, 침, 객담, 흉막삼출액 및 기관지 세척액, 자궁경부 도말표본(pap smear), 분변, 눈물, 땀, 소변 등 거의 모든 체액 및 검사에 활용되는 부산물 등이 액체 생검으로 활용될 수 있다. 하지만, 현재 기술 수준에서 주요하게 활용되는 액체생검 시료이자, 이 주제에서 사용하고자 하는 혈액에 대해서만 우선적으로 정리하였다.
혈액
혈액은 가장 널리 활용되는 액체 생검의 시료로, 암을 이루는 다양한 구성요소를 대표할 수 있는 분석 시료를 얻을 수 있다. 현재 기술 수준에서 혈액 내 대표적인 액체 생검 시료인 ctDNA 및 RNA, 순환종양세포, 엑소좀 기반 분석은 다음과 같이 활용될 수 있다.
1. 순환종양세포 (김동균, 기초학부 2학년; 토론창 참조)
순환종양세포(Circulating Tumor Cell; CTC)는 원발암과 전이 병변으로부터 혈관으로 침투하거나 흘러나온 종양세포의 일종이다. 대개 혈액 세포 10 억 개 당 1 개꼴로 존재하지만, 그마저도 종양 유형별로 다양하다. 현재 순환종양세포를 분리하는 다양한 기술이 개발되어 있는데, 크기와 생물 물리학적 특징 기반 분리, EpCAM과 같은 상피세포 표면 표지인자를 마커로 한 분리방법, 정상세포와 구분하기 위한 이미징 분석법이 병용되고 있다. 크기 기반 분리는 일반적으로 순환종양세포가 일반세포보다 크기 때문인데, 표지인자에 대한 칵테일 항체로 선별하는 방법을 병행하여 수득률을 효과적으로 높인다. 
단백질, DNA, RNA 분석에 활용되는 다양한 접근법들이 순환종양세포를 규명하는 데 활용되기도 한다. ex vivo에서 분리한 순환종양세포는 in vitro 및 in vivo 분자 분석 및 기능 분석을 위해 활용할 수 있어, 암 생물학 분야에서 새로운 정보들을 얻을 수 있다. 대표적인 예로는 약물내성 질환 재발 전후의 환자 혈액 시료에서 분리한 순환종양세포의 이종이식 모델을 통해, 새로운 약물의 표적을 발굴하는데 활용한 연구가 있다. 세포주 및 동물시험 기반 약물 스크리닝, 인체생리활성 모사의 한계를 극복할 대안으로 최근 가장 주목받고 있는 3D 오가노이드(유사장기) 모델에 순환종양세포가 활용될 수 있음을 보여주는 결과도 보고되었다.
2. 순환종양 RNA(ctRNA)
순환하는 종양연관 mRNA, miRNA(microRNA), lncRNA(long noncoding RNA, 긴 비코딩 RNA)가 순환계에서 동정되었고, 이미 그 임상적 중요성이 제시된 바 있다. 순환종양 mRNA 분석을 통해 암과 연관된 특이적인 유전자 발현 프로파일을 규명할 수 있고, 체세포 변이 정보 뿐 아니라 후성 유전적 변화 관련 정보까지 얻을 수 있다. miRNA는 순환종양 RNA 중 혈액 내 가장 많이 존재하는 순환 RNA로 암의 발생과 발달과정에서 특정 miRNA의 주요기능이 많이 보고되고 있고, 진단의 주요지표로 제시되고 있다. 순환종양 RNA 종은 엑소좀에 탑재되어 전달되는 주요 구성 물질이기도 하다. 때문에 비침습적인 진단 바이오마커로서 가치가 높다.
3. 엑소좀 (고지연, 기초학부 2학년; 토론창 참조)
엑소좀(exsomses) 및 분비성 미세소포(small multivesicular vesicles, sMV)는 모든 세포들로부터 생성 및 분비되어 체액에 존재하는 세포외소포체(small extracellular vesicles, EVs)의 일종이다. 1000~5000 nm부터 30~150 nm의 작은 크기에 이르기까지 다양하고, 분비 분자기작, 기능적 특징에 있어서도 다양하다. 엑소좀의 생합성 특성상 다른 세포외소포체(EVs)와 달리 엔도좀(endosome, 내포) 구성 물질들이 존재하기 때문에 모세포의 본질을 대표할 수 있다.
엑소좀은 정상밀도 구배 원리분리, 초고속 원심분리로 분리하고, 투과 현미경 및 특정 단백질 마커(CD63, CD9, CD81) 기반 검출로 선별할 수 있다. 세포외소포에는 다양한 miRNA, mRNA, lncRNA가 탑재되어 인접세포 및 원거리세포에 정보를 전달하고, 미세 환경을 조정하는데 활용된다. 때문에 임상 중개연구 및 치료 전략으로서 가치가 높다.
발암 유전자에 의해 형질전환 된 세포의 EVs에서 암 연관 단백질들이 증가했고, Evs를 통해 정상세포의 증식을 촉진할 수 있음이 알려진 바 있다. 모세포의 생리적 특성 및 정보를 EVs(엑소좀 및 분비성 미세소포)를 통해, 인접해 있거나 원거리에 있는 세포에 전달하여 수령세포의 물질대사를 리프로그래밍하고 세포 간 상호작용을 조절할 수 있다. 
암세포는 단계적으로 진행되는 암 발달 과정동안 인접해 있는 기질세포(섬유아세포), 신생혈관 형성 조절, 면역세포 및 면역반응 조절 등 암 미세환경 조정을 위해 세포외 소포를 정상세포에 비해 다량으로 분비하여 리프로그래밍에 활용한다. 때문에, 암 진단지표로 활용가치가 높고 엑소좀 및 분비성 미세소포를 표적으로 하는 새로운 치료법 개발이 가능하다. 최근에는 EVs를 약물전달체계로 활용하여 악성세포의 특성을 바꿀 수 있는 RNA를 EVs에 탑재하는 연구도 진행된 바 있다.
4. ctDNA (김지윤, 기초학부 2학년; 토론창 참조)
비세포성 DNA(cfDNA)의 존재는 1948년에 최초 보고되었고, 1977년 암 환자에서 cfDNA 양이 증가되어 있다고 확인되었다. 이후 종양 연관 유전적 변이(발암 유전자 및 암 억제 유전자 변이, 미소위성체 불안정성, 후성 유전적 변화)와 cfDNA와의 관련성이 보고되었다. 순환종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)는 세포사멸, 세포괴사, 분비를 통해 혈액이나 다양한 체액에서 순환되는 작은 크기(~142bp)의 DNA로, 신장, 간, 비장에서 빠른 시간 내에 제거된다, cfDNA 반감기는 약 16분에서 2.5 시간 정도로 추정된다. 최근 진단기술의 발전과 차세대 염기서열 분석법(NGS) 및 PCR 기술의 발전으로 암의 진단 및 병리, 생리적 상태를 모니터링 할 수 있는 지표로 주목을 받고 있다. 특히 종양 특이적인 전유전체 정보를 확보할 수 있어서 암의 비균질성을 완전히 재현할 수 있고, 암 치료과정 동안 약물의 반응 및 내성 변화를 모니터링 하는데 중요한 정보를 제공할 수도 있어, 그 잠재적 가치가 높다.
ctDNA 농도는 동일한 암 유형과 유사한 병기의 환자들 사이에서도 크게 다르며 전이확산 및 종양 크기 차이와 연관되어 있다고 알려져 있다. 또한 ctDNA는 순환종양세포가 검출되지 않은 암환자에서도 검출되기 때문에, 진단지표로서 가치가 더욱 높다. 또한 바이러스에서 유래한 핵산 정보가 삽입되어 있기도 한데, 이를 통해 바이러스 감염(HPV, HBV) 유도 암에 관한 정보를 제공하기도 한다. 암에서 유래한 ctDNA는 단일 변이 분석, 전유전체 분석이 이루어지는데, 대립형질 특이적 PCR(allele-specific PCR) 및 디지털 PCR이 대표적으로 활용된다.
5. 혈소판 (김태형, 기초학부 2학년; 토론창 참조)
최근 RNA biomarker panel에 대한 비침습 biomarker trove로 tumor-educated platelets(TEP)의 잠재력이 주목받고 있다. TEP는 여러 고형 종양의 진행 및 확산에 관여하며, 이러한 TEP는 암의 존재, 위치 및 분자 특성에 대한 특정 정보를 제공 할 수 있다. 지금까지 폐, 뇌 및 유방암을 포함한 다른 종양 유형의 환자에서 얻은 TEP 샘플이 테스트되었으며, 암 환자의 TEP는 염증성 및 기타 비 암성 질병과는 다른 것으로 나타났다. 혈소판이 어떻게 "교육"되는지, 그리고 특정 혈소판 아 집단의 상대적 기여가 암 환자에서 변화하는지 여부는 여전히 연구되어야 한다. 그렇지만 궁극적으로, TEP는 액체 생검 진단에 사용되는 현재 사용되는 바이오 소스 및 생체 분자를 보완하여 잠재적으로 초기 단계에서 암의 검출을 향상시키고 비침습성 질환 모니터링을 촉진할 수 있다.

액체 생검의 임상 중개의학적 활용

단일세포 이질성 연구

단백질 발현정도, 치료반응, 증식률 등 종양의 비균질성을 대표하는 다양한 차이는 종양 내 존재하는 다양한 세포군, 그리고 단일세포 수준의 이질성에서 그 원인을 찾을 수 있다. 때문에 국소적인 종양 조직 생검을 표적으로 한 기존의 치료전략이 재발, 거대전이(macrometastasis), 약물 내성, 재발 등을 진단하고 질병의 예후를 예측하는데 한계가 있었다. 액체 생검 내 순환종양세포, 확산종양세포(disseminated tumor cell), 암 줄기세포, ctDNA 등은 종양 내 이질성을 대표하는 단일 세포수준에서 분석하여 포괄적인 정보를 얻을 수 있는 주요 시료가 될 수 있다. 교모세포종에서 얻은 세포 430개를 단일세포 RNA 염기서열 분석법으로 분석하여 신호 전달, 세포증식, 면역반응 및 암 줄기세포성 연관 유전자 발현의 다양성을 증명함으로써 종양 내 비균질성을 제시한 바 있다.
임상 및 중개연구 도구로서의 잠재적 중요성
액체생검 분석은 임상적 가치가 매우 높다. 액체 생검을 통해 시공간적으로 적합한 지점에서 진단이 가능하고, 질병 진행과정 동안 종양 특이적 변이를 규명하고 추적할 수 있으며 치료결정의 주요한 지침을 제공할 수 있기 때문이다.
바이오마커로서 중요한 순환종양세포
종양세포는 면역 체크포인트 단백질 PD-L1을 발현하고, T세포의 PD-L1과 결합하여 면역계를 불활성시킴으로서 살아남은 전략을 취한다. PD-L1은 혈액 내 순환종양세포에서 빈번하게 발현되므로 순환종양세포 기반 PD-L1 분석법은 향후 임상시험이 가능한 환자를 분류, 면역체크포인트에 대한 반응을 모니터링하는데 유용하게 활용될 수 있다.
암 진단에 활용되는 ctDNA
종양환자의 체액 내 ctDNA 농도가 정상인에 비해 높고 종양 단계에 따라 증가하는 양상을 보이며, 질병 진행없는 생존율과 ctDNA 농도 간 유의미한 상관관계를 보인다.
ctDNA 메틸화 패턴 분석, 항암 반응 예측
종양억제 유전자와 연관된 CpG 부위의 프로모터에서 발생하는 과도한 메틸화 현상은 많은 암의 발병과 관련되어 있어 ctDNA의 메틸화 정도는 유용한 바이오마커로 활용된다.
치료 반응 검증, 재발 및 치료 저항성 예측
ctDNA 수치를 정량함으로써 수술 및 치료 후 최소 잔존 질병(MRD)를 모니터링할 수 있고, 재발의 위험성을 예측할 수도 있다.
클론 진화 모니터링
표적치료는 종양세포를 선택적으로 억제함으로써 특정 클론의 진화를 유발할 수 있고, 액체 생검을 통해 이러한 클론의 역동적 변화를 포착할 수 있다. 즉 암환자에게 존재하는 유전자의 클론 변이를 모니터링하면 종양 위험성을 추적할 수 있다.
임상적 활용
액체 생검 분석을 환자치료에 적용하기 위해서는 ctDNA 염기서열 분석법의 정확성이 관건이다. 액체 생검에 매칭되는 조직 DNA의 염기서열 분석 기준에 부합하는 것이어야 한다. 원발암을 조기 진단하는 것은 아직까지 정상인에 대한 대규모 임상시험에서나 가능한 일이다. 액체 생검 기반 기술이 시장에 출시되기 위해서는 임상적 일치성 및 검증시험과 활용연구에 대한 기준이 마련되어야 한다. 현재 NGS 기술의 선두기업인 일루미나사를 비롯해 존슨앤존슨, 로슈와 같은 대형 제약사와 다수의 신생기업이 다양한 암에 대해 액체 생검 기반 진단 시험법을 개발 중에 있다.

결론 및 전망

최근 FDA에서 원발부위와 무관한 항암제들에 대해 적응증 확대 승인을 한 바 있다. 이러한 결정은, 고형암의 비균질성을 대변할 수 없는 현재의 약물 개발 플랫폼, 약물 치료 전략의 한계를 인식하고, 동반진단 및 환자 개개인의 유전체 기반으로 한 맞춤형 의학, 정밀의학으로 이행하려는 동향을 방증하는 것이다. 
또한 2016년 6월 미국 FDA는 비소세포폐암 EGFR 표적치료제인 얼로티닙(Erlotinib, 제품명: Tarceva)에 대한 동반진단 검사법인 코바스 EGFR 변이 검사 v2(Cobas EGFR Mutation test v2)를 승인했다. 로슈 분자시스템(Roche molecular system)이 개발한 이 검사법은, 조직생검이 어려운 비소세포폐암 환자의 혈액 내 ctDNA로부터 EGFR 유전자변이 여부를 확인하는 방법이다. 엑손 18의 G719X 치환 변이, 엑손 19의 결실 변이, 엑손 20의 T790M, S768I 치환 및 삽입 변이, 엑손 21의 L858R, L861Q 치환 변이 등 총 42개의 변이를 검출할 수 있다. 혈중 ctDNA(circulating tumor DNA, 순환종양 DNA)의 검출, 분석 기술의 FDA 승인은 액체생검 시장 확대의 신호탄이 되었다. 지노믹헬스(GenomicHealth)도 ctDNA를 검출하여 악성종양의 변화와 치료 반응, 내성과 연관된 4가지 형태의 유전자변이를 분석하는 검사법을 개발하고 있다. 바이오셉트(Biocept)는 ctDNA 및 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)를 모두 검사할 수 있는 플랫폼을 개발, 비소세포폐암 환자의 EGFR, KRAS, ALK 변이분석 검사법을 개발하고 있다. 트로바진(Trovagene)은 소변과 혈액 내 ctDNA를 분석하여 비소세포폐암 발암 유전자 EGFR, KRAS, BRAF 변이 검사, 암의 치료 반응을 모니터링하는 플랫폼을 개발하고 있다. 미세유체시스템 기반 순환종양세포 및 엑소좀(exosome) 분리 기술 개발도 활발하다. 
더 이상 액체생검은 불과 몇 년 전에 예측했던 미래 유망 기술이 아니다. 액체생검을 활용한 연구 결과와 제품 개발에 대한 보고들이 쏟아지고 있다. 암 줄기세포 연구, 암 유전체, 암 대사작용, 암 미세환경 리모델링, 면역감시 균형을 활용한 면역 항암제 개발, 일주기 리듬을 고려한 항암치료, 마이크로바이옴에 의한 항암제 약물대사 조절 및 대사산물의 중요성, 엑소좀을 통한 암 신호 교환, 전달 등 암 생물학을 시스템적으로 이해하기 시작했고, 이를 기반으로 한 항암제 개발 시장도 확대되고 있다.
보다 정확하게 필요한 적기에 질병의 병리, 생리적 상황을 모니터링 할 수 있는 시스템의 필요성, 환자의 편의성을 고려한 비침습적 처치에 대한 수요 증가, 종양의 비균질성 및 역동적 암 미세 환경을 포괄적으로 고려한 진단과 치료전략의 요구 등에 부합하는 새로운 분석법과 전략이 필요한 시점이다. 이러한 필요와 염기서열 분석법 및 진단기술의 발전으로 액체 생검의 중요성이 부각되고 있는 상황이다.
하지만, 시료검출 및 염기서열 분석법은 여전히 기술적 한계가 존재하고, 시료를 확보하기 위한 분리방법 및 분석법이 표준화되지 않아 편향된 결과를 도출할 가능성이 있다. 또한 액체생검의 주요 분석시료인 ctDNA, 순환종양세포와 세포외소포인 엑소좀의 분자생물학적, 세포생물학적 이해가 여전히 부족한 상황이다. 현재 대부분의 치료결정은 아직까지 조직표본 검사 결과에 기초를 두고 있다. 하지만 분석기술의 지속적인 발전과 제한된 조직시료 검사의 한계점을 극복하기 위해 액체 생검 기반 질병의 진단 및 임상적 중요성이 더욱 높아질 것이다. 이에 해당 도전과제를 통해 개발하고자 하는 마이크로플루이딕스 기반 액체 생검의 통합적인 분리기술의 필요성을 강조하고자 한다.
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