단백질 손상 기반 세포노화모델 확립과 세포노화에서의 단백질 분해 효소 체계 역할 규명

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단백질 손상 기반 세포노화모델 확립과 세포노화에서의 단백질 분해 효소 체계 역할 규명
Year 2020
Title 단백질 손상 기반 세포노화모델 확립과 세포노화에서의 단백질 분해 효소 체계 역할 규명
Authors 안재현, 윤태현, 이정한, 이혜수, 임다빈
Abstract
Keywords protein damaged induced senescence, senescence, proteostasis

Introduction

Theory

Method

 PD: Population doubling., 매주 cell line 내 세포 수를 세어, 세포가 얼마나 많이 증가하는지 나타낸다. 
 present PD = last PD +log_(2)(present cell number / last cell number). 일반적으로 PD값이 2주간 1미만으로 증가하였을 때, 이를 노화했다고 본다.
 또한 추가로 beta gal assay를 노화 확인 방식으로 사용하였다. 전체 cell 중 노화 cell의 비율을 beta-gal assay를 통해 알 수 있으며 통상적으로 70% 이상이 염색되었다면 이를 노화했다고 간주한다.

실험은 두 가지로 나뉜다.

첫 번째 실험은 PDIS model을 기반으로 하여, Protein damage를 야기하는 약물 내에서 세포를 배양하며 매 주 세포 수 변화를 PD(Population Doubling) graph로 나타낸다. 이는 PDIS model을 검증하는 자료로 사용할 것이다.

 약물, Sodium cyannate, Sodium Arsenite, Amino acid analog(canavanine (Can) and azetidine-2-carboxylic acid (AZC))를 각각 고농도, 중간농도, 저농도 2개씩 (각 약물 당 6개의 세포군 배양, 총 20개의 세포군 배양) 에서 세포 배양하였다.

두 번째 실험은 protein damage-induced 약물 환경 내 (실험군) / control media에서 10cm plate에서 각각 3개의 세포군을 배양한 뒤, cell line 내에서 특징적인 유전자 패턴을 분석하는 방식으로 진행되었다.

이 과정을 그림으로 도식화하면 다음과 같다.

각 well에서 고농도, 중간농도, 저농도 약물을 매주 지정된 요일만큼 투여함
1주간 일반 media 배양 후 10cm plate에서 같은 방식으로 노화까지 배양


또한 첫번째 실험에서는 2주간 PD 증가값이 1 미만으로 나타날 경우 실험을 중지하는 방식으로 실험을 진행하였고, 3만여 개 이상의 세포가 있을 경우(생존), 노화를 beta-gal assay로 확인(double-check)하였다.

두번째 실험에서는 PD값이 약 45에 이르렀을 때,(일반적으로 PD값이 50에 가까이 닿았을 때, 세포가 노화함) 실험을 중지한 뒤 분석업체에 보내는 방식으로 진행되었으며, 추가로 beta-gal assay를 통해 노화를 확인하였다.

Result

1. PD graph 제작

각 약물을 고농도, 중간농도, 저농도에서 세포를 배양한 뒤 노화까지 PD그래프를 제작하였고, 그 결과는 다음과 같다.

UGRP Sene high.pngUGRP Sene mid.pngUGRP Sene low.png
각 약물에서 노화 확인 시점은 대개 8주차로 동일하였다. 다만 3만 개의 세포를 seeding하였으나, 더 적은 수의 세포가 확인된 경우, 그래프 내에 8주차 지점을 표기하지 않았다.

2. Rna seq sample 노화 확인

각 cell을 분석업체에 보내기 이전, beta-gal assay를 통해 약 45정도의 PD value에서 노화 정도를 확인하였다.

Control, PD value:46.75, 노화 비율: 6.5%
AAA 약물 내 배양, PD value: 46.247, 노화 비율 86.5%


또한 다음 그래프를 통해 실험군과 대조군 내에서 노화정도를 비교하였다. (almost same PD value)

실험군과 대조군 내 노화정도 비교


Conclusion

Future studies

Protein damage-induced 약물을 처리한 실험군에서 나타나는 유전자를 분석하여(DEG analysis, differentially Expressed Genes), PDIS model과 연관있는 노화관련 유전자를 분석하는 것이 추후의 과제가 될 것이다.

Reference