단백질 손상 기반 세포노화모델 확립과 세포노화에서의 단백질 분해 효소 체계 역할 규명
| 단백질 손상 기반 세포노화모델 확립과 세포노화에서의 단백질 분해 효소 체계 역할 규명 | |
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| Year | 2020 |
| Title | 단백질 손상 기반 세포노화모델 확립과 세포노화에서의 단백질 분해 효소 체계 역할 규명 |
| Authors | 안재현, 윤태현, 이정한, 이혜수, 임다빈 |
| Abstract | |
| Keywords | protein damaged induced senescence, senescence, proteostasis |
Introduction
Method
PD: Population doubling., 매주 cell line 내 세포 수를 세어, 세포가 얼마나 많이 증가하는지 나타낸다. present PD = last PD +log_(2)(present cell number / last cell number). 일반적으로 PD값이 2주간 1미만으로 증가하였을 때, 이를 노화했다고 본다. 또한 추가로 beta gal assay를 노화 확인 방식으로 사용하였다. 전체 cell 중 노화 cell의 비율을 beta-gal assay를 통해 알 수 있으며 통상적으로 70% 이상이 염색되었다면 이를 노화했다고 간주한다.
실험은 두 가지로 나뉜다.
첫 번째 실험은 PDIS model을 기반으로 하여, Protein damage를 야기하는 약물 내에서 세포를 배양하며 매 주 세포 수 변화를 PD(Population Doubling) graph로 나타낸다. 이는 PDIS model을 검증하는 자료로 사용할 것이다.
약물, Sodium cyannate, Sodium Arsenite, Amino acid analog(canavanine (Can) and azetidine-2-carboxylic acid (AZC))를 각각 고농도, 중간농도, 저농도 2개씩 (각 약물 당 6개의 세포군 배양, 총 20개의 세포군 배양) 에서 세포 배양하였다.
두 번째 실험은 protein damage-induced 약물 환경 내 (실험군) / control media에서 10cm plate에서 각각 3개의 세포군을 배양한 뒤, cell line 내에서 특징적인 유전자 패턴을 분석하는 방식으로 진행되었다.
이 과정을 그림으로 도식화하면 다음과 같다.
또한 첫번째 실험에서는 2주간 PD 증가값이 1 미만으로 나타날 경우 실험을 중지하는 방식으로 실험을 진행하였고, 3만여 개 이상의 세포가 있을 경우(생존), 노화를 beta-gal assay로 확인(double-check)하였다.
두번째 실험에서는 PD값이 약 45에 이르렀을 때,(일반적으로 PD값이 50에 가까이 닿았을 때, 세포가 노화함) 실험을 중지한 뒤 분석업체에 보내는 방식으로 진행되었으며, 추가로 beta-gal assay를 통해 노화를 확인하였다.
Result
실험은 PD graph를 완성함으로써 protein damage-induced 약물 미디어 내 배양과 대조군 배양에서 변화를 관찰하는 방식 및 DEG 분석을 진행하는 방식으로 진행된다.
1. PD graph 제작
각 약물을 고농도, 중간농도, 저농도에서 세포를 배양한 뒤 노화까지 PD그래프를 제작하였고, 그 결과는 다음과 같다.
- 각 약물에서 노화 확인 시점은 대개 8주차로 동일하였다. 다만 3만 개의 세포를 seeding하였으나, 더 적은 수의 세포가 확인된 경우, 그래프 내에 8주차 지점을 표기하지 않았다.
- 고농도 약물 media 환경 내에서는 control과 비교하였을 때 PD값이 확실히 적은 값에서 노화가 진행됨을 확인할 수 있다. (AAA 고농도 약물 내, PD 약 44에서 노화. As의 경우, PD value = 49. Cy의 경우, PD value= 52. Ctrl 경우 PD value = about 56에서 노화)
- 저농도 약물 media 환경 내에서는 ctrl media 내 배양과 비해 크게 PD value가 차이나지 않음을 확인할 수 있다. 또한 단백질 항상성이 작용한 것으로 보인다. 하지만 어느 정도의 PD value 종결 값에 차이는 보였다.
2. Rna seq sample 노화 확인
각 cell을 분석업체에 보내기 이전, beta-gal assay를 통해 약 45정도의 PD value에서 노화 정도를 확인하였다.
또한 다음 그래프를 통해 실험군과 대조군 내에서 노화정도를 비교하였다. (almost same PD value)
- 또한 control내 세포 배양 well과 AAA 약물 내 세포 배양 well은 비슷한 PD value(about 45)에서 확실한 노화 비율의 차이를 보였다. Ctrl의 경우 노화 비율 약 8%, 실험군의 경우 노화비율 약 83%. 배양 시기 역시 거의 동일하다.
- 각 약물 media 내에서의 DEG 관찰은 추후 진행 예정이다. (Future studies 참고)
Discussion
Future studies
Protein damage-induced 약물을 처리한 실험군에서 나타나는 유전자를 분석하여(DEG analysis, differentially Expressed Genes), PDIS model과 연관있는 노화관련 유전자를 분석하는 것이 추후의 과제가 될 것이다.
