단백질 손상 기반 세포노화모델 확립과 세포노화에서의 단백질 분해 효소 체계 역할 규명

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단백질 손상 기반 세포노화모델 확립과 세포노화에서의 단백질 분해 효소 체계 역할 규명
Year 2020
Title 단백질 손상 기반 세포노화모델 확립과 세포노화에서의 단백질 분해 효소 체계 역할 규명
Authors 안재현, 윤태현, 이정한, 이혜수, 임다빈
Abstract Our research team present new senescence model, PDIS(Protein Damage Induced Senescence) model. To get experimental data to prove PDIS model, we treated several PDI(protein damage inducer) to IMR90 in three each different concentration. PD(population doubling) was checked from each of the sample. After 8 weeks from first PDI treatment, we got complete data from each concentration. Data from second high and lowest concentration show less distinction compared to data from highest-concentration treated sample. AAA considered to be most powerful inducer of senescence in designated concentration followed by As(Sodium Arsenite) and Cy(Sodium Cyanate). Percentage of senescent cell from PDI treated sample and control sample showed clear distinction which prove PDI do induce cellular senescence. We request RNA sequence analysis of control and AAA treated sample at around PD value is 45. Through this, DEG analysis between control and AAA treated cell and comparison with other senescence model cell are in progress.
Keywords protein damaged induced senescence, senescence, proteostasis

Introduction

최근 들어 각광받고 있는 분야중 하나로 생각되는 ‘노화’에 관한 연구는 사실 비교적 이전부터 진행되어 왔다. 노화모델을 크게 분류하는 기준으로 ‘노화를 일으키는 가장 근본적이고 주된 원인이 무엇인가’를 들 수 있는데, 이렇게 분류된 노화모델의 예시로는 oncogen-induced model, telomere-related model, epigenetic alteration model 등이 존재한다. 이와 함께 protein 가공, 생산 오류기반 모델도 등장하였다.

단백질 오류관련 대표적인 model로는 Orgel의 error catastrophe theory of aging을 들 수 있다. 이 model은 protein의 transcription, translation error가 produced protein의 error을 일으키고 이는 다시 transcription, translation error을 일으키는 positive feedback loop를 이룬다는 것이다. 즉, 증폭된 error가 aging을 유발하게 된다는 것이 orgel의 주장이다. 하지만 이 model은 현대의 protein homeostasis(proteostasis) 관련 연구결과들을 설명하기에 부족함이 있음은 명백한 사실이다.

이 연구를 통해 제안하고자 하는 노화 model은 proteostasis에 기반한 Protein Damage Induced Senescence model(PDIS model)이다. 해당 모델에 따르면, 기존에 다른 노화모델에서 노화의 원인과 같은 여러 요소들이 protein error를 야기하고, 이러한 error가 축적되어 certain threshold를 넘어서게 되면 노화한다고 말할 수 있겠다. 하지만, PDIS model이 더욱 일리 있는 model이 되기 위해서는 기존에 존재하는 다른 노화모델과의 연관성을 알아내는 것이 중요하다. 다른 노화모델의 pathway와 공유하는 부분을 가지는지 혹은, 다른 노화모델의 중요 특징이 PDIS model로 설명할 수 있는 점인지 등을 예로 들 수 있을 것이다.

우리는 이를 위한 초석을 다지기 위해, 두 가지 실험을 진행하였다. 첫째로, PDIS model을 실험적으로 입증하였다. 또한 Protein Damgae Inducer(PDI)가 유발할지도 모르는 genetic modification의 가능성의 확인하였다.

Method

 PD: Population doubling., 매주 cell line 내 세포 수를 세어, 세포가 얼마나 많이 증가하는지 나타낸다. 
 present PD = last PD +log_(2)(present cell number / last cell number). 일반적으로 PD값이 2주간 1미만으로 증가하였을 때, 이를 노화했다고 본다.
 또한 추가로 beta gal assay를 노화 확인 방식으로 사용하였다. 전체 cell 중 노화 cell의 비율을 beta-gal assay를 통해 알 수 있으며 통상적으로 70% 이상이 염색되었다면 이를 노화했다고 간주한다.

실험은 두 가지로 나뉜다.

첫 번째 실험은 PDIS model을 기반으로 하여, Protein damage를 야기하는 약물 내에서 세포를 배양하며 매 주 세포 수 변화를 PD(Population Doubling) graph로 나타낸다. 이는 PDIS model을 검증하는 자료로 사용할 것이다.

 약물, Sodium cyannate, Sodium Arsenite, Amino acid analog(canavanine (Can) and azetidine-2-carboxylic acid (AZC))를 각각 고농도, 중간농도, 저농도 2개씩 (각 약물 당 6개의 세포군 배양, 총 20개의 세포군 배양) 에서 세포 배양하였다.

두 번째 실험은 protein damage-induced 약물 환경 내 (실험군) / control media에서 10cm plate에서 각각 3개의 세포군을 배양한 뒤, cell line 내에서 특징적인 유전자 패턴을 분석하는 방식으로 진행되었다.

이 과정을 그림으로 도식화하면 다음과 같다.

1st exp.각 well에서 고농도, 중간농도, 저농도 약물을 매주 지정된 요일만큼 투여함
2nd exp. 1주간 일반 media 배양 후 10cm plate에서 같은 방식으로 노화까지 배양


또한 첫번째 실험에서는 2주간 PD 증가값이 1 미만으로 나타날 경우 실험을 중지하는 방식으로 실험을 진행하였고, 3만여 개 이상의 세포가 있을 경우(생존), 노화를 beta-gal assay로 확인(double-check)하였다.

두번째 실험에서는 PD값이 약 45에 이르렀을 때,(일반적으로 PD값이 50에 가까이 닿았을 때, 세포가 노화함) 실험을 중지한 뒤 분석업체에 보내는 방식으로 진행되었으며, 추가로 beta-gal assay를 통해 노화를 확인하였다.

Result

실험은 PD graph를 완성함으로써 protein damage-induced 약물 미디어 내 배양과 대조군 배양에서 변화를 관찰하는 방식 및 DEG 분석을 진행하는 방식으로 진행된다.

1. PD graph 제작

각 약물을 고농도, 중간농도, 저농도에서 세포를 배양한 뒤 노화까지 PD그래프를 제작하였고, 그 결과는 다음과 같다.

UGRP Sene high.pngUGRP Sene mid.pngUGRP Sene low.png

  • 각 약물에서 노화 확인 시점은 대개 8주차로 동일하였다. 다만 3만 개의 세포를 seeding하였으나, 더 적은 수의 세포가 확인된 경우, 그래프 내에 8주차 지점을 표기하지 않았다.
  • 고농도 약물 media 환경 내에서는 control과 비교하였을 때 PD값이 확실히 적은 값에서 노화가 진행됨을 확인할 수 있다. (AAA 고농도 약물 내, PD 약 44에서 노화. As의 경우, PD value = 49. Cy의 경우, PD value= 52. Ctrl 경우 PD value = about 56에서 노화)
  • 저농도 약물 media 환경 내에서는 ctrl media 내 배양과 비해 크게 PD value가 차이나지 않음을 확인할 수 있다. 또한 단백질 항상성이 작용한 것으로 보인다. 하지만 어느 정도의 PD value 종결 값에 차이는 보였다.


각 PD값을 table로 정리



2. Rna seq sample 노화 확인

각 cell을 분석업체에 보내기 이전, beta-gal assay를 통해 약 45정도의 PD value에서 노화 정도를 확인하였다.

Control, PD value:46.75, 노화 비율: 6.5%
AAA 약물 내 배양, PD value: 46.247, 노화 비율 86.5%


또한 다음 그래프를 통해 실험군과 대조군 내에서 노화정도를 비교하였다. (almost same PD value)

실험군과 대조군 내 노화정도 비교


  • 또한 control내 세포 배양 well과 AAA 약물 내 세포 배양 well은 비슷한 PD value(about 45)에서 확실한 노화 비율의 차이를 보였다. Ctrl의 경우 노화 비율 약 8%, 실험군의 경우 노화비율 약 83%. 배양 시기 역시 거의 동일하다.
  • 각 약물 media 내에서의 DEG 관찰은 추후 진행 예정이다. (Future studies 참고)

Discussion

PD graph를 통해서 약물의 농도와 상관없이 Control의 PD값이 제일 크고, 노화된 시점이 다른 대조군보다 일찍 찾아오지 않았다. 또한 beta gal staining의 결과 사진을 비교분석한 결과, 비슷한 PD값에서 PDI(AAA)를 처리한 cell들이 control의 cell들보다 평균적으로 10배가량 더 많은 노화된 cell들이 관찰되었고 AAA를 처리한 실험군의 경우 83.1%라는 상당히 노화가 진행된 모습을 보인다. 이러한 결과는 PDI가 proteostasis를 붕괴하여 cell의 노화하는 시점을 앞당기고, 세포 내의 단백질 대사를 저해함을 보여줌으로써 PDIS model을 뒷받침한다. 이와 관련한 genetic modification 분석은 추후에 진행될 예정이다.

Future studies

Protein damage-induced 약물을 처리한 실험군에서 나타나는 유전자를 분석하여(DEG analysis, differentially Expressed Genes), PDIS model과 연관있는 노화관련 유전자를 분석하는 것이 추후의 과제가 될 것이다.

Reference

  • Orgel LE (1963) The maintenance of the accuracy of protein synthesis and its relevance to ageing. Proc Natl Acad Sci United States 49:517–521
  • Ryan, J. M., Duda, G., & Cristofalo, V. J. (1974). Error Accumulation and Aging in Human Diploid Cells. Journal of Gerontology, 29(6), 616–621. https://doi.org/10.1093/geronj/29.6.616
  • Kevei, É., & Hoppe, T. (2014). Ubiquitin sets the timer: impacts on aging and longevity. Nature Structural & Molecular Biology, 21(4), 290–292. https://doi.org/10.1038/nsmb.2806
  • López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., & Kroemer, G. (2013). The Hallmarks of Aging. Cell, 153(6), 1194–1217. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.05.039